[发明专利]一种大鲵虹彩病毒MCP抗原的制备方法及其应用

摘要

本发明公开了一种大鲵虹彩病毒MCP抗原的制备方法及其应用。本发明在大鲵虹彩病毒MCP蛋白天然表达基因基础上，依据杆状病毒表达系统对密码子的偏爱性进行了基因修饰，并通过优化表达条件显著提升了重组表达基因在杆状病毒表达系统中的表达效率。在此基础上，本发明应用免疫磁珠法对表达的目的蛋白进行纯化，该纯化方法具有很高的纯度和收率。本发明还公开了一种检测大鲵虹彩病毒抗体的ELISA检测试剂盒。

主权项

一种大鲵虹彩病毒MCP抗原的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、以CGSIV‑LY分离株MCP基因序列(GenBank No.KF023635)为原始模板，根据杆状病毒表达系统密码子的偏爱性人工合成CGSIV MCP基因的序列，修饰后的基因序列如SEQ ID NO.2所示；根据人工修饰合成的MCP基因序列和杆状病毒穿梭载体pFastBac1所含的酶切位点，设计特异扩增引物，分别引入EcoR I、Hind III酶切位点，PCR扩增人工修饰MCP基因；引物序列如下：P1：5′‑CCGGAATTCATGTCTTCTGTAACTGG‑3′(EcoR I)；P2：5′‑CCCAAGCTTTTACAAGATTGGGAATCC‑3′(Hind III)；总体积为50μL的反应体系为：0.5μL的T5U/μL的TaKaRa Ex Taq，5.0μL10×Ex Taq Buffer(Mg2+ Plus)，0.25nmol/L dNTPs 4.0μL，引物50pmol/L各1.0μL，DNA模板1μL，ddH2O补充至50μL；反应条件为：95℃ 3min，95℃ 45s，60℃ 45s，72℃ 1min，30个循环，72℃充分延伸10min；10g/L的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，胶回收PCR产物；S2、将回收的人工修饰的MCP基因连接到pMD‑18T载体，反应体系(总体积为10μL)：1μL pMD‑18T载体、2μL回收的核酸片段、5μL ddH20、1μL10×Ligase Buffer、1μL T4DNA Ligase。充分混匀后，16℃低温水浴槽中连接过夜。转化大肠杆菌感受态细胞后过夜培养；菌落PCR方法检测目的片段是否连接到载体pMD‑18T上；S3用质粒DNA小量提取试剂盒提取质粒，分别用EcoR I和Hind III限制性内切酶双酶切pFastBac1载体和重组质粒，回收纯化后用T4 DNA连接酶连接，再转化至E.coli DH5α感受态细胞中，涂布含AMP(100mg/mL)的平板，筛选阳性克隆，挑取阳性克隆扩大培养后用质粒抽提试剂盒抽提质粒，进行酶切鉴定及测序，将鉴定正确的重组质粒命名为pFastBac‑MCP；S4、将重组质粒pFastBac‑MCP转化E.coli DH10Bac感受态细胞，涂布三抗(Gen、Kan、Tet)、Bluo‑gal、IPTG平板进行蓝白斑筛选，挑取白色菌落三次划线纯化，经M13通用引物和MCP特异性引物PCR初步鉴定后，测序进一步鉴定，将确认结果正确的阳性重组转座子，命名为rBacmid‑MCP；S5、通过碱裂解法提取rBacmid‑MCP质粒，然后将2μg的rBacmid‑MCP质粒与10μL转染试剂轻轻混合后转染于细胞密度约为1×106个/mL的Sf9单层细胞，27℃继续培养，待80％细胞出现病变后，收集细胞上清标记为P1代重组杆状病毒病毒，将P1代重组病毒继续感染Sf9细胞，经3代扩大培养，得宿主细胞上清；S6、将所得的宿主细胞上清与制备好的免疫磁珠混匀，37℃孵育2h，用磁力架收集磁珠，洗涤2次，将磁珠悬浮于500μL pH2.5Gly‑HCl，孵育5min，磁力收集磁珠，上清用100μL pH8.0Tris‑HCl中和，即获得纯化后的大鲵虹彩病毒MCP抗原。