[发明专利]基于磁性分离和量子点标记的副溶血性弧菌检测试剂盒

摘要

本发明公开了一种基于磁性分离和量子点标记的副溶血性弧菌检测试剂盒，它包括：抗副溶血性弧菌免疫磁珠、量子点标记的抗副溶血性弧菌的纳米荧光生物探针；所述的抗副溶血性弧菌免疫磁珠是羧基化磁珠利用EDC和NHS活化后，再与兔抗副溶血性弧菌多克隆抗体IgG共价偶联；所述的纳米荧光生物探针是羧基化的荧光量子点活化后，与副溶血性弧菌鸡卵黄抗体IgY偶联；利用本发明制备的试剂盒进行副溶血性弧菌的检测具有特异性强、重复性好、灵敏度高的优点，可用于对食品中副溶血性弧菌的快速检测。

主权项

1.基于磁性分离和量子点标记的副溶血性弧菌检测试剂盒，它包括：抗副溶血性弧菌免疫磁珠、量子点标记的抗副溶血性弧菌的纳米荧光生物探针； 所述的抗副溶血性弧菌免疫磁珠是羧基化磁珠利用EDC和NHS活化后，再与兔抗副溶血性弧菌多克隆抗体IgG共价偶联；所述的纳米荧光生物探针是羧基化的荧光量子点活化后，与副溶血性弧菌鸡卵黄抗体IgY偶联；所述的副溶血性弧菌鸡卵黄抗体IgY是以副溶血性弧菌全菌为抗原，经灭活后，免疫SPF级健康高产蛋鸡，采用PEG6000法对所述的免疫后鸡蛋中的卵黄抗体IgY进行纯化；蛋白浓度为1mg/mL；所述的抗副溶血性弧菌免疫磁珠是由下述方法制备的：①取羧基化磁珠100 μL至1.5 mL离心管中，置于磁力架上磁性分离后弃去上清，加入MEST缓冲溶液400μL清洗3次；所述MEST缓冲液各成分含量如下：0.1mol/L 2‑(N‑吗啡啉)乙磺酸，0.5 mL/L吐温‑20；所述的MEST缓冲液pH为 5.0；②依次加入浓度为10 mg/mL的1‑（3‑二甲氨基丙基）‑3‑乙基二亚胺盐酸盐MEST缓冲液的溶液200μL， 浓度为10 mg/mL的N‑羟基琥珀酰亚胺MEST缓冲液的溶液200μL，利用垂直混合仪在25℃下活化30min；反应结束后用PBST清洗3遍；所述的PBST缓冲液各成分：8g NaCl，0.2 g/L KCl、1.44 g/L Na2HPO4、0.24 g KH2PO4，0.5 mL/L Tween‑20；所述的PBST缓冲液pH为7.4；③活化后的磁珠，置于纳米磁分离器中进行磁分离后移除上清，向各离心管中加入用PBST缓冲液稀释的副溶血性弧菌兔多克隆抗体IgG孵育2h漩涡混匀后，利用垂直混合仪在25℃下反应2 h；偶联反应结束后，置于磁力架上磁性分离后弃去上清，400 μL PBST溶液清洗3遍，加入1 mL 1%的BSA封闭；封闭结束后，置于纳米磁分离器中进行磁分离后移除上清，用400μL uLPBS缓冲液洗涤3遍后， 重悬于400μL的PBS溶液中，4℃保存；所述的PBS缓冲液各成分含量如下：8g NaCl，0.2 g/L KCl、1.44 g/L Na2HPO4、0.24 g KH2PO4；所述的PBS缓冲液pH为7.4；所述的量子点标记的抗副溶血性弧菌的纳米荧光生物探针由下述方法制备的：取10 uL羧基化的荧光量子点于1.5 mL棕色进样瓶中，加入用MEST缓冲液配制的5mg/mL EDC和5mg/mL NHS各200μL，漩涡混匀后，利用垂直混合仪在25℃下活化30min；活化结束后将溶液转移至微量离心管中，12000 rpm 离心5min；弃去上清并用PBST清洗1遍，活化后的量子点重悬于400μL的PBST中；加入副溶血性弧菌鸡卵黄抗体IgY 120μg，漩涡混匀后利用垂直混合仪在25℃下避光反应2 h；将量子点溶液移至微量离心管中，12000 rpm 离心5min，弃去上清并用PBST清洗1遍；加入1mL 1%的BSA，涡旋混匀后利用垂直混合仪在25℃下继续避光孵育1h进行封闭；封闭结束后，将量子点溶液转移至1.5 mL的EP管中，12000 rpm 离心5min，弃去上清并用PBST清洗1遍；重悬于400μL的PBS溶液中，4℃保存。