[发明专利]一种适用于产孢真菌核型分析的染色体DNA制备方法

摘要

本发明属于生物技术领域，涉及一种适合于产孢真菌核型分析的染色体DNA制备方法，其特征在于：包括分生孢子收集、孢子琼脂糖块制备、原生质体琼脂糖块制备、完整染色体琼脂糖块制备等步骤，操作简单，且能获取高浓度、完整的染色体DNA，能够直接用于真菌核型分析和遗传育种研究。

主权项

1.一种适用于产孢真菌核型分析的染色体DNA制备方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)分生孢子收集：将产孢真菌进行液体培养后过滤菌液，得到分生孢子悬浮液，离心，用EDTA溶液洗涤2次，再将孢子悬浮在EDTA溶液中，制成浓度为2×10⁸/ml的分生孢子悬浮液；(2)孢子琼脂糖块制备：将步骤(1)中分生孢子悬浮液与琼脂糖等体积混合制成孢子琼脂糖块，把孢子琼脂糖块放入3‑4℃凝固10‑15min；(3)原生质体琼脂糖块制备：将步骤(2)中的孢子琼脂糖块放入酶液中，于36‑37℃酶解3‑4h，用无菌水洗涤2次；酶液配方为：破壁酶5‑10mg/mL，NaCl0.6M，NaH₂PO₄ 8.4mM，Na₂HPO₄ 1.6mM，pH5.8；(4)完整染色体琼脂糖块制备：将步骤(3)中酶解后的琼脂糖块放入NDS缓冲液中，于45‑55℃水浴中裂解22‑25h，重复1次；NDS缓冲液配方为：SDS 1‑2％、蛋白酶K2mg/ml，Tris‑HCl 1M，EDTA 0.5M，pH8.0；(5)将步骤(4)中的琼脂糖块，用TE缓冲液在48‑53℃下洗涤2次，每次0.8‑1.4h，然后浸在TE缓冲液中并保存在4℃备用。