[发明专利]放线菌JY-22抗真菌成分分离方法及其在复配剂中的应用

摘要

本发明公开了放线菌JY‑22抗真菌成分分离方法，包括如下步骤：JY‑22菌株发酵液抗真菌成分的初步提取、大孔树脂D101富集活性物质、硅胶柱层析分离纯化抗生素JY‑22、SephadexLH‑20柱层析、高效液相色谱制备分离、高效液相色谱分析即分离提纯到放线菌JY‑22抗真菌成分；本发明还公开了放线菌JY‑22抗真菌成分的复配剂：所述复配剂按体积分数计，浓度为3mg/L‑4mg/L的吡唑醚菌酯1‑2份，浓度为120mg/L‑130mg/L的放线菌JY‑22粗提浸膏6‑7份。本发明提供了一种新的吸水链霉菌JY‑22抗真菌活性物质分离工艺，该抗真菌活性物质对多种有害真菌具有很好抑制作用。

主权项

1.放线菌JY‑22抗真菌成分分离方法，其特征在于：包括如下步骤：S1：JY‑22菌株发酵液抗真菌成分的初步提取，取菌株JY‑22发酵液离心，收集上清液旋转蒸发得到浓缩发酵液，在浓缩发酵液中加入乙醇并沉降，离心后取上清液旋转蒸发得到二次浓缩液，然后用石油醚萃取二次浓缩液，再用正丁醇萃取二次浓缩液，最后收集正丁醇部分旋转蒸干，得到抗生素粗提浸膏；S2：大孔树脂D101富集活性物质，将粗提浸膏用去离子水溶解后上样于装有大孔树脂的玻璃柱，静置吸附，依次用2‑3倍柱体积的去离子水、浓度为30％‑35％的乙醇、浓度为90％‑95％的乙醇洗脱，收集90‑95％乙醇的部分，减压旋转蒸干后用甲醇溶解得到粗提物A；S3：硅胶柱层析分离活性物质，用适量甲醇溶解粗提物A得到样品一，然后按照200‑300目硅胶与样品一的质量比例为1:1进行混匀伴样，然后按照硅胶与样品一的质量比例为45：1进行装柱，再以6‑8份体积分数的甲醇、2‑3份体积分数的氯仿、0.1‑0.3份体积分数的氨水、剩下的以水补齐作为溶媒和流动相，然后用薄层板点板合并相同组分，再用抑菌圈法检测活性，收集活性组分得到粗提物B；S4：SephadexLH‑20柱层析，用适量甲醇溶解粗提物B得到样品二，将样品二缓慢加入装有聚糖凝胶LH‑20的玻璃柱中，再用甲醇洗脱，薄层层析点板合并相同组分，抑菌圈检测活性，收集活性组分一后用体积比为(5‑6)：(4‑5)的甲醇和水的混合液溶解，缓慢加入装有葡聚糖凝胶LH‑20的玻璃柱中，再用体积比为(5‑6)：(4‑5)的甲醇和水的混合液洗脱，用薄层层析点板合并相同组分得到粗提物C；S5：高效液相色谱制备分离，对粗提物C进行液相分离，以变化浓度的甲醇与加入0.5％浓氨水的去离子水作为流动相，流动相洗脱条件:0‑30min70％‑80％甲醇，30‑40min90％‑95％甲醇，C18柱作为固定相，200‑400nm检测，收集各个明显单峰，抑菌圈法检测活性；S6：高效液相色谱分析，Shimadzu LC‑20AD型高效液相色谱仪用Inertsil C18柱，洗脱剂选择甲醇和加入0.5％浓氨水的去离子水，流动相洗脱条件0‑15min80％‑85％甲醇，15‑25min90％‑95％甲醇，检测波长220nm，进样量12μL。