[发明专利]一种基于三维皮肤模型和树突状细胞共培养模式的皮肤致敏检测方法

摘要

本发明公开了一种基于三维皮肤模型和树突状细胞共培养模式的皮肤致敏检测方法，包括以下步骤1.皮肤模型前期制备；2.树突状细胞的制备与培养；3.皮肤模型与树突状细胞共培养构建和受试物暴露；4.皮肤模型活性测试；5.皮肤模型基因组检测；6.共培养模型下层细胞分泌物检测；7.树突状细胞表面标志物表达检测；8.统计方法和结果预测。本发明把具有屏障和代谢功能的体外重建的3D皮肤与具有免疫功能的树突状细胞组合在一起，建立了共培养的新型实验系统，与体内具有相似的功能和致敏感反应；本发明可以从定性和定量两方面评价待测物质的皮肤致敏作用；本发明方法可代替活体动物和人体，直接预测化学品、化妆品、药品等可能导致的皮肤致敏。

主权项

一种基于三维皮肤模型和树突状细胞共培养模式的皮肤致敏检测方法，其特征是包括以下步骤：步骤1.皮肤模型前期制备；步骤2.树突状细胞的制备与培养；步骤3.皮肤模型与树突状细胞共培养构建和受试物暴露：将购置或自制的皮肤模型孵育在一个与之大小匹配的6孔、12孔或24孔培养皿中：如果皮肤模型为吊篮式，将其直接悬挂于培养皿壁；如果皮肤模型为插入式，直接将其置于培养皿内；培养皿中已经添加2mL含酚红的MEM培养基，但无细胞；孵育在温度为37.5±0.5℃、湿度90±8％和5±1％CO2的培养箱环境中，时间为12‑24h，备用；孵育结束后，将皮肤模型转移至与之大小匹配的6孔、12孔或24孔培养皿中，培养皿中已培养有树突状细胞，形成共培养体系；在皮肤模型表面直接进行受试物的处理，处理剂量为15‑50μL，处理时间为15‑60min；随后清洗皮肤模型表面受试物，并将皮肤模型与铺有细胞的培养皿一同孵育6±1h，每种受试物分别设置50％，10％，1％和0.1％四个浓度，每个浓度设置3组平行模型；待6±1h孵育结束后，将三组平行的皮肤模型，取其中一组进行细胞活性测试，另外二组进行基因组表达测试；培养下层的树突状细胞进行表面标志物检测和细胞分泌物检测；实验设置对照组，包括溶剂对照和阳性对照；必要时增加基准物质对照；必要时，选择仅含皮肤模型或仅含树突状细胞的单一培养模型作为对照，用于比较共培养系统与单一培养系统在致敏预测能力方面的差异；步骤4.皮肤模型活性测试；步骤5.皮肤模型基因组检测：将皮肤模型从固定支架取下，并将细胞层与支架层简易剥离，随后将两者放入准备好的TRIzol试剂中分离获取总RNA；将1μg总RNA加入含有随机引物的20μl总体积液体中，其中含有SuperScript反转录酶III，根据反转录仪器操作说明进行相关RNA的反转录；接着，利用寡核苷酸引物进行PCR扩增，最后通过电泳法检定基因的成分；鉴别皮肤刺激和皮肤致敏的候选基因组来源于下述表1中的基因群，具体的表面标志物分类为a组、b组和另外c‑j组中任意至少1组：a)刺激基因组；b)凋亡基因组；c)减毒/解毒基因组；d)细胞死亡基因组；e)细胞应激基因组；f)热休克蛋白基因组；g)炎性基因组；h)MHC代谢基因组；i)蛋白酶体基因组；j)组织修复基因组；表1 皮肤模型中用于判断皮肤致敏情况的基因群步骤6.共培养模型下层细胞分泌物检测；步骤7.共培养模型下层细胞表面标志物表达检测：取共培养下层细胞采用流式细胞仪进行细胞表面标志物检测，在流式细胞术之前，使用蛋白阻断剂对细胞的表面抗原进行非特异性阻断，试剂保持在2～8℃，细胞所处的环境在暗室及温度在2～8℃；收集受试物作用后下层培养皿中的细胞，每孔分别移入相应的1mLEP管中，使用离心机离心收集细胞；并用缓冲液清洗一次，同样的条件下离心收集细胞；FcR阻断：使用FcR阻断剂附带说明书标明的浓度进行配制，随后将离心获得的细胞进行阻断，以消除非特异性结合对后期抗体表达量化检测的影响；抗体染色：将上述细胞根据细胞数量和抗体荧光标记选择特定的同型对照，随后根据试剂盒上的浓度提示进行抗体染色；流式细胞术或荧光酶标仪检测器检测抗体染色后的荧光强度；首先，对本批次细胞建立1组文件夹，包括实验组、同型对照组、溶剂对照组；然后，通过无处理的空白对照组细胞调节实验FSC vs SSC的实验电压，以确保本批次细胞后续实验的结果计算；再者，绘制FSC vs SSC和各组荧光组合的图，调节阳性组别的单染抗体下的电压补偿；最后，通过得到的图谱，分组获取相对荧光强度(RFI)值；计算公式如下：荧光强度均值(MFI)＝荧光强度几何平均数；步骤8.统计方法和结果预测：将上述步骤获得的各组实验数据，以均数±标准差表示，采用SPSS22.0统计软件进行分析，多组之间差异的比较用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK检验法，显著性水平α＝0.05，P＜0.05表示差异具有统计学意义，使用FlowJo 7.6对荧光强度进行统计分析；根据不同检测参数的意义，从统计结果分析，作出如下皮肤致敏预测：A.皮肤模型基因表达情况：实验组基因表达相对空白组增加2‑7倍，即认为该物质在该浓度下可以引起该基因的显著性表达；实验组与空白组相比，刺激基因组别24个基因超过20个有显著性表达，可以认为该物质只具有皮肤刺激性，可不做后续致敏相关基因表达测试；另外的基因表达如果超过95％的基因呈现大于2‑7倍的显著性增高，则可认为该物质在该浓度下有皮肤致敏潜能；B.共培养系统下层细胞分泌物检测情况：使用试剂盒进行检测期间，如有标准曲线，则标准曲线R2需要至少大于0.999，没有标准曲线情况下，阳性参照物组别相对空白组别，目的分泌物的减少或增加至少具有显著性的统计学差异；阴性参照物组别相对空白组别，目的分泌物的减少或增加至少具有显著性的统计学差异；待测物质处理后的细胞组别，根据实验情况，与空白组别进行统计学比较，根据统计学推断对结果的符合性进行判断；C.树突状细胞表面标志物预测：在细胞活率大于50％前提下，对于多数树突状细胞均具有的表面标志物中，CD86的相对荧光强度的均数与空白组相比增加大于1.5倍，CD54的相对荧光强度的均数与空白组相比增加大于2倍，该物质致敏性判断为阳性；其他情况下判断为阴性物质。