[发明专利]一种人类冻存单个核细胞高效扩增NK细胞的方法

摘要

本发明涉及细胞生物学领域，具体公开了一种人类冻存单个核细胞(PBMC)高效扩增自然杀伤(NK)细胞的方法。抽取外周血利用密度梯度分离法提取出单个核细胞，冻存后单个核细胞按照本发明方法体外诱导增殖成CD3‑CD56+型自然杀伤细胞，其细胞扩增数量可以达到诱导前的1000多倍，细胞比例高达90％，细胞杀瘤性高达87％。冻存单个核细胞与新鲜血液提取出单个核细胞在诱导成杀伤细胞数量、杀瘤性、活性均无显著性差异。本发明为老年人健康保健和肿瘤患者过继免疫治疗提供了一个切实可行方法。

主权项

一种人类冻存单个核细胞高效扩增NK细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将冻存的单个核细胞融化，将融化后细胞悬液迅速转移到NK‑EX培养液中，离心，弃上清，将沉淀细胞打散，将细胞接种至包被CD3/CD28T细胞激活剂的培养瓶中，加入刺激液和AB血浆于培养瓶中，使培养体系中的细胞密度达到(1～1.5)×106个/mL、AB血浆的体积浓度达到5％，记为D0天；(2)D3天解除刺激，将培养瓶中的细胞悬液离心，弃上清，将沉淀细胞打散，将细胞接种至新的包被CD3/CD28T细胞激活剂的培养瓶中，加入扩增培养基和AB血浆于培养瓶中，使培养体系中的细胞密度达到(1～1.5)×106个/mL、AB血浆的体积浓度达到10％；(3)在D5天和D7天向培养的细胞悬液中补加扩增培养基和AB血浆，使体系中的细胞密度维持在(1～1.5)×106个/mL、AB血浆的体积浓度维持在15％；(4)在D9天向培养的细胞悬液中补加扩增培养基和AB血浆，使体系中的细胞密度维持在(1～1.5)×106个/mL、AB血浆的体积浓度维持在10％；(5)在D11天及之后的每隔一天，向培养的细胞悬液中补加扩增培养基和AB血浆，使体系中的细胞密度维持在(1～1.5)×106个/mL、AB血浆的体积浓度维持在2～3％；(6)在D14天后对细胞悬液进行采样细胞计数，当连续两天的细胞计数结果变化不大于10％时，开始收集细胞。