[发明专利]一种3D表皮模型的构建方法

摘要

本发明属于组织工程技术领域，具体涉及一种3D表皮模型的构建方法。该方法用丝裂霉素C（Mitomycin C，MC）处理的成纤维细胞作为滋养层，在其上接种角质形成细胞，利用成纤维细胞分泌的各种因子和蛋白等供给角质形成细胞生长需要，同时配合低浓度血清及EGF、胰岛素及CaCl2，经液下及气液面两个阶段的培养，构建形成3D表皮模型。本发明所构建的3D表皮模型与人体表皮结构高度一致，且降低了生产成本，满足规模化生产3D表皮模型所需的经济、有效且高效的要求。

主权项

一种3D表皮模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、将复苏好的成纤维细胞消化后重悬计数，按照3×104/cm2～6×104/cm2的密度将复苏后的成纤维细胞接种于含血清的培养液中，于CO2培养箱中培养18h～24h后弃去培养液，然后加入含丝裂霉素C的培养液，于二氧化碳培养箱中处理2h～6h后弃去培养液，用PBS缓冲溶液冲洗3～5次，得到成纤维细胞滋养层；步骤二、将复苏好的角质形成细胞消化后重悬计数，按照接种密度计算所需细胞量，然后按照1×105/cm2～5×105/cm2的密度将重悬后的角质形成细胞接种至步骤一中所述成纤维细胞滋养层表面，再置于液下培养液中进行液下培养，每天换液，液下培养48h后转入气液面培养液中进行气液面培养，每天换液，得到3D表皮模型；所述液下培养液以低糖型DMEM培养液、α‑MEM培养液、F12培养液或DF12培养液为基础液，添加胎牛血清、氯化钙、EGF表皮生长因子和胰岛素，液下培养液中胎牛血清的体积百分含量为1%～5%，氯化钙的浓度为0.1mM～0.5mM，EGF表皮生长因子的浓度为0.01μg/mL～0.1μg/mL，胰岛素的浓度为0.05mM～2mM；所述气液面培养液以低糖型DMEM培养液、α‑MEM培养液、F12培养液或DF12培养液为基础液，添加胎牛血清、氯化钙、EGF表皮生长因子和胰岛素，气液面培养液中胎牛血清的体积百分含量为1%～5%，氯化钙的浓度为1.0mM～1.5mM，EGF表皮生长因子的浓度为0.01μg/mL～0.1μg/mL，胰岛素的浓度为0.05mM～2mM。