[发明专利]一种暗紫贝母野生鳞茎快速繁殖的方法

摘要

本发明公开了一种暗紫贝母野生鳞茎快速繁殖的方法，该方法包括以下步骤：无菌小鳞片的获得；无菌小鳞片愈伤组织和丛生芽的诱导；丛生小鳞茎的增殖培养；再生小鳞茎的生根诱导；生根小鳞茎的移栽驯化。采用本发明的技术方案，暗紫贝母增殖率较前人研究有所提高；解决了暗紫贝母再生小鳞茎增殖过程中易褐化、生根难、畸形根多等问题。

主权项

1.一种暗紫贝母野生鳞茎快速繁殖的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、无菌小鳞片的获得：从野外采集暗紫贝母2‑3年生鳞茎，带回实验室进行消毒处理，处理过程为先在自来水中用湿棉布清洗干净鳞茎外表面泥沙；然后从鳞茎基部分离鳞片，自来水冲洗2‑12h；再转至超净工作台，依次用70％酒精处理30‑40s，无菌水冲洗2‑3次，0.1％Hg Cl₂处理6‑10min，无菌水冲洗3‑5次；最后转接入MS基本培养基进行模拟原生境环境温条件暗培养，昼夜温度为18‑20℃/8‑12℃，期间注意观察污染情况，及时转接未污染材料至新的MS培养基中，培养20‑30d后，获得一定数量的无菌小鳞片；步骤2、无菌小鳞片愈伤组织和丛生芽的诱导：在前期测定暗紫贝母原生境地土壤营养元素的基础上，设计L16(45)正交试验，考虑母液类型、TDZ浓度、KT浓度、IAA浓度和NAA浓度5个因素，优化无菌小鳞片愈伤组织和丛生芽诱导的配方；其中愈伤组织诱导的配方为MS+0.5‑1.0mg/L TDZ+0.5‑1.0mg/L KT+0.1‑0.2mg/L IAA+0.1‑0.2mg/L NAA+琼脂粉5.8g/L+蔗糖30g/L；增殖配方为自配1+0.5‑1.0mg/L TDZ+0.05‑0.1mg/L KT+0.05‑0.1mg/L IAA+0.01‑0.05mg/L NAA+琼脂粉5.8g/L+蔗糖30g/L，其中自配1根据暗紫贝母原生境地土壤营养元素含量而设计，培养条件与步骤1相同；步骤3、丛生小鳞茎的增殖培养：基于前期研究发现，暗紫贝母丛生小鳞茎在增殖过程中易出现玻璃化和褐化现象，在转入增殖培养基后，采取了10‑12℃低温连续培养30‑45d后，再进行正常变温暗培养，培养基采用自配1+1.0‑2.0mg/L 6‑BA+0.1‑0.2mg/L NAA+琼脂粉5.8g/L+蔗糖30g/L，昼夜温度为18‑20℃/8‑12℃；步骤4、再生小鳞茎的生根诱导：待再生小鳞茎长至一定大小后，将其分离成单个小鳞茎，转入生根培养基中，进行生根培养；暗紫贝母生根困难、粗壮肉质根出现频率较高，因此在进行生根培养时要筛选健壮的再生小鳞茎为生根材料，生根前需提前在4‑12℃低温下培养10‑20d，以抑制小鳞茎玻璃化和增加生根率，培养基配方为自配1+NAA0.1‑0.5mg/L，培养条件同步骤1，待根长0.5‑1cm时，开始移栽驯化；步骤5、生根小鳞茎的移栽驯化：生根小鳞茎的出瓶时间选择每年的4‑5月，将无菌生根小鳞茎连同培养瓶一起运往原生境地进行驯化栽培，移栽前将生根小鳞茎小心从培养瓶取出，洗净根表面培养基，再放入80％甲基托布津1000倍液中浸泡1‑5min后，移栽到原生境土中，期间注意人工调控炼苗温度为12‑20℃，湿度80％；遮阴80％以上，待小鳞茎芽出土后，逐渐去除遮阳网，上述增殖配方为自配1其详细组分为5.794mg/L NH₄NO₃+42.372mg/L(NH₄)₂HPO₄+110.91mg/L CaCl₂.2H₂O+13.913mg/L MgSO₄+16.895mg/L KH₂PO₄+24.186mg/L Na₂HPO₄。