[发明专利]基于流式结合ICP-MS单细胞蛋白检测的样本前处理方法

摘要

本发明公开了一种基于流式结合ICP‑MS单细胞蛋白检测的样本前处理方法，属于流式细胞术的样品前处理技术领域。本发明包括(1)全血样本的采集和运输，(2)PBMC细胞分离，(3)细胞活性染色，(4)细胞刺激，(5)细胞固定，(6)表面抗体染色，(7)胞内磷酸化蛋白染色和(8)单细胞标记等步骤，将金属元素标签标记的抗体与细胞表面抗原结合，将标记好的细胞与作为内参用于标准化的beads混合，前处理过程中区分死细胞与活细胞，以免出现死细胞数量过多影响实验结果的分析与阐述，区分单细胞与细胞二聚体、三聚体甚至多聚体，能很好的满足流式结合ICP‑MS单细胞蛋白检测需求。

主权项

基于流式结合ICP‑MS单细胞蛋白检测的样本前处理方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)全血样本的采集和运输：采集全血样本，样本中添加抗凝剂，常温保存运输；(2)PBMC细胞分离：采用Ficoll淋巴细胞分离液对全血样本中的细胞进行分离；(3)细胞活性染色：采用顺铂对分离的细胞进行染色，染色时间控制在5‑10min，染色结束后离心去上清液，对细胞进行重悬；(4)细胞刺激：将细胞转移至培养箱中培养15～30min，使细胞恢复“静息”状态，并根据适当的刺激物及刺激方法对细胞进行分组刺激；(5)细胞固定：对步骤(4)中重悬的细胞进行PFA固定、冻存；(6)表面抗体染色：将PFA固定、冻存的细胞融化后，重悬，加入细胞染色缓冲液，离心去除上清后，加入Blocking Mix重悬，常温静置后加入cocktail混匀；(7)胞内磷酸化蛋白染色：将表面抗体染色后的细胞用PBS和甲醇处理后，用cell staining Buffer重悬，加入磷酸化抗体cocktail混匀，常温孵育之后用Cell Staining Buffer清洗去上清；(8)单细胞标记：步骤(7)中染色后的细胞用PBS缓冲液重悬，滴加入含有金属元素标记物的cell intercalation溶液进行标记，随后分别用Cell Staining Buffer和水进行清洗，最后将细胞重悬于含有EQ beads的水中保存。