[发明专利]一种利用生物柴油副产物制备金合欢烯的方法

摘要

本发明公开了一种利用生物柴油副产物制备金合欢烯的方法。该方法包括生物柴油副产物的纯化，纯化后甘油的纯度达到63.8％(w/w)；也包括以纯化后甘油为原料制备金合欢烯的重组宿主细胞的构建，该重组宿主细胞包含甲羟戊酸途径或者脱氧木酮糖‑5‑磷酸途径中的相关基因，异戊烯焦磷酸异构酶基因，金合欢烯焦磷酸合成酶基因和金合欢烯合成酶基因，且包括以纯化后甘油为原料在重组宿主细胞中发酵制备金合欢烯，所得金合欢烯的浓度为0.025g/L；还包括以纯化后甘油为原料优化构建可提高金合欢烯产量的重组宿主细胞，所得金合欢烯浓度达到2.9g/L，比优化前金合欢烯的浓度提高115倍。

主权项

一种利用生物柴油副产物制备金合欢烯的方法，其特征在于包括步骤如下：(1)生物柴油副产物的纯化：a.通过离心除去生物柴油副产物中的不溶性物质；b.通过蒸馏方法除去生物柴油副产物中的甲醇；c.通过加入磷酸中和已除去甲醇的生物柴油副产物，离心分离，获得纯化后甘油，用于金合欢烯制备；(2)以生物柴油副产物为原料生产金合欢烯的重组宿主细胞的构建：a.通过NCBI数据库查询和基因工程技术手段获得合成金合欢烯的相关基因，包括甲羟戊酸途径或者脱氧木酮糖‑5‑磷酸途径中的基因，异戊烯焦磷酸异构酶基因，金合欢烯焦磷酸合成酶基因和金合欢烯合成酶基因；b.构建多种在同一宿主细胞中兼容的重组质粒，所述的多种重组质粒在宿主细胞中通过启动子转录和宿主细胞翻译共同表达合成金合欢烯的相关蛋白；c.多种重组质粒转化导入宿主细胞中获得合成金合欢烯的重组宿主细胞。(3)将上述所述的重组宿主细胞接种到含有上述所述的纯化后甘油的培养基中进行异源诱导表达制备金合欢烯。(4)以上述所述的纯化后甘油为底物构建提高金合欢烯产量的重组宿主细胞：a.根据多种重组质粒的启动子的转录能力，优化相应启动子携带基因的种类和个数，多种已优化的重组质粒共同表达合成金合欢烯的相关蛋白，并平衡代谢路径中各个基因的蛋白表达水平；b.将多种已优化的重组质粒转化导入宿主细胞中获得提高金合欢烯产量的重组宿主细胞；c.将上述所述的重组宿主细胞接种到含有上述所述的纯化后甘油的培养基中进行异源诱导表达高产金合欢烯。