[发明专利]一种采用ddPCR鉴定PML‑RARα融合基因中Brc2亚型的方法

摘要

本发明公开了一种采用ddPCR鉴定PML‑RARα融合基因中Brc2亚型的方法，该方法包括提取血液中的RNA并进行QC评估，还包括RNA反转录cDNA并进行QC评估。本发明ddPCR检测PML‑RARA融合bcr2亚型可达0.01%的丰度，远超RT‑PCR的0.1%，重复性好，无假阳性；在低AF（0.01%）的情况下，建议样本投入量增加，或重复多个平行操作。由于该技术的高灵敏度，因此可应用于疾病的早期确诊、动态监测和防治复发。本发明针对常见的Brc2型，设计检测fusion探针，引物针对fusion两侧序列进行扩增；将RARA基因作为内参，设计Ref探针，引物仅扩增RARA基因。

主权项

一种采用ddPCR鉴定PML‑RARα融合基因中Brc2亚型的方法，其特征在于：一、该方法包括提取血液中的RNA并进行QC评估，具体操作过程如下：（1）提取RNA，将血浆分装在1.5ml EP管中，每管分装300μl；（2）使用天根试剂盒中自带的细胞裂解液CL，加入750μl至血液中，上下颠倒混匀，静置1min；10000rpm离心1min；弃上清，留沉淀；再加入700μl CL至血液中，同等条件下离心，弃上清，留沉淀；（3）加入150μl buffer PKD，吹打混匀；然后加入10μl蛋白酶K，吹打混匀；勿配置mix，需单独依次加入；（4）样本于恒温仪56℃、转速350rpm、15min后迅速置于冰上3min；（5）13400rpm离心15min，转移上清160μl至1.5ml EP管中；（6）将上清置于恒温仪上80℃ 孵育15min，13400rpm快速离心30s；（7）加入320μl buffer RLT，吹打混匀，再加入1000μl 96～100%乙醇，涡旋混匀；（8）每次转移700μl样本至RNeasy MinElute离心柱中，13400rpm离心15s，弃滤液，重复本步骤直到将所有样本过柱完毕；（9）加350μl buffer FRN到离心柱，13400rpm离心15s，弃滤液；（10）配mix:10μl DNaseI和70μl buffer RDD，吹打混匀，将其加到离心柱中的膜上，置于室温20～30℃温度下15min；（11）加500μl buffer FRN至离心柱，13400 rpm离心15s，保留滤液；换一个新的2ml收集管，将滤液重新加入到离心柱，13400rpm离心15s，弃滤液；（12）加入500μl buffer RPE至离心柱，13400rpm离心15s，弃滤液，重复一次；（13）将离心柱置于新的2ml收集管中，管盖打开，13400rpm离心5min；（14）将离心柱置于新的1.5ml EP管中，加入25μl RNase‑free water至离心柱中央的滤膜上，闭合管盖，室温15～25℃温度下静置1min；13400rpm 离心1min；（15）提取的RNA立即进行反转录或冻存于‑80℃；（16）RNA QC评估：使用Nanodrop对RNA进行定量并参考A260/280数据，或者使用labchip /2100进行RNA质量评估，评估RIN值；二、该方法还包括RNA反转录cDNA并进行QC评估，具体操作过程如下：（1）RNA反转录cDNA，反转录引物与模板RNA结合：待PCR程序结束后，放置于冰上，不少于1 min；HELA作为control只需投入1ul，即10ng即可；（2）准备RT反应混合液及进行RT孵育：将7ul mix加入至上一步的13ul中，吹打混匀，反应总体系20ul，在PCR上进行反转录反应，反应完成后存放至‑20℃保存；（3）cDNA QC评估：采用试剂盒自带的HELA control primer，进行PCR反应，跑胶验证条带，质控反转录反应的完成情况。