[发明专利]一种快速构建禽传染性支气管炎病毒反向遗传株的方法

摘要

本发明公开了一种快速构建禽传染性支气管炎病毒反向遗传株的方法，属于冠状病毒反向遗传技术领域。所述构建方法包括：以BAC载体为骨架，运用体外同源重组技术，快速完成包含禽传染性支气管炎病毒基因组全长cDNA克隆的构建，将构建的重组质粒直接转染细胞，在细胞内转录获得具有感染性的转录本，并完成病毒包装，将细胞与培养基的混合液接种SPF鸡胚并传代，获得禽传染性支气管炎病毒反向遗传株。该构建方法操作简单，阳性克隆率高，而且获得的反向遗传株具有传代稳定性，为体外研究病毒的致病机理、开发新型疫苗等提供了有效的工具；本发明利用5’添加的CMV启动子，在细胞内进行转录，利用3’添加的HDVR序列，大大提高了病毒的拯救效率。

主权项

一种快速构建禽传染性支气管炎病毒反向遗传株的方法，包括以下步骤：(1)根据禽传染性支气管炎病毒基因组序列以及BAC载体多克隆位点，设计n对含有同源臂的引物，以禽传染性支气管炎病毒RNA反转录产物cDNA为模板，分别扩增出基因组序列的n个片段，命名为f1、F2、…Fn‑1、fn，n为偶数，n≥4，其中F2～Fn‑1的首尾部分序列与相邻片段重复；利用体外同源重组技术，分别将上述扩增片段克隆到BAC载体上，获得亚克隆载体pBAC‑f1、pBAC‑F2、...pBAC‑Fn‑1、pBAC‑fn；(2)以含有巨细胞病毒启动子序列的质粒为模板，扩增得到含有同源臂的CMV序列，利用体外同源重组技术，将其融合到pBAC‑f1基因组序列的5’端，获得亚克隆载体pBAC‑F1；(3)克隆丁型肝炎核酶序列和牛生长激素聚腺苷酸化信号序列，融合PCR获得HB序列；以所述HB序列为模板，扩增得到含有同源臂的HB序列，利用体外同源重组技术，将HB序列融合到pBAC‑fn基因组序列的3’端，获得亚克隆载体pBAC‑Fn；(4)将pBAC‑F1、pBAC‑F2、...pBAC‑Fn‑1、pBAC‑Fn依次两两配对，每对中，取其中一个亚克隆载体作为模板，扩增出含有同源臂的目的片段，利用体外同源重组技术，将目的片段融合到另一个亚克隆载体上，获得相邻两片段融合的亚克隆载体pBAC‑F1F2、…pBAC‑Fn‑1Fn；(5)再按照步骤(4)的方法，将相邻的两个亚克隆载体进行融合，重复若干次，获得包含禽传染性支气管炎病毒基因组全长cDNA的克隆载体pBAC‑IBV；(6)将克隆载体pBAC‑IBV转染细胞，培养、收集培养基及细胞混合物，反复冻融，获得P0代拯救毒；(7)将P0代拯救毒接种SPF鸡胚，传代、获得所述禽传染性支气管炎病毒反向遗传株。