[发明专利]一种艾伯特埃希菌的检测方法

摘要

本发明公开了一种艾伯特埃希菌的检测方法，所述方法包括基于eae基因PCR初筛、乳糖不发酵等特点的艾伯特埃希菌分离培养初筛程序；诊断性三重PCR、基于16S rDNA序列分析、MLST分析的艾伯特埃希菌的鉴定程序。本发明利用了艾伯特埃希菌在低温时仍能生长的特性，通过降低一次增菌的温度至20℃，抑制了大肠杆菌的生长，此时艾伯特埃希菌成为该温度下生长的优势菌，进而使得艾伯特埃希菌一次增菌中的菌体浓度提高6个滴度(106)，以大大提高艾伯特埃希菌一次增菌的效率以及艾伯特埃希菌的检出率，这为艾伯特埃希菌鉴定程序的建立打下基础。

主权项

一种艾伯特埃希菌的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：1)按照1:10的重量百分比采集25g食品+225ml EC肉汤增菌液；3ml脑心‑甘油肉汤保存液+2ml稀大便或2g干粪便的混合液+9ml EC肉汤增菌液，于20℃培养18‑36h；2)取1ml上述EC肉汤增菌液，8000rpm离心3min集菌，弃上清；用150μl裂解液悬菌，振荡使沉淀充分混匀，水煮10min；12000rpm离心5min，取上清即为PCR反应模板；eae基因PCR初筛引物为eae‑F:CAGGATCGCCTTTTTTATACG和eae‑R:CTCTGCAGATTAACCTCTGC进行PCR初筛；PCR反应体系为：在20μl体系中，2×Taq MasterMix 10μl，10μM上、下游引物各1μl，DNA模板1μl，纯水7μl；PCR反应条件：预变性94℃2min，变性94℃30s，退火55℃30s，延伸72℃45s，30次循环，最后延伸72℃5min，每次实验均设有阴、阳性对照；PCR产物以1.5wt％琼脂糖凝胶进行电泳检测；3)用接种环挑取3环上述初筛eae阳性增菌保存液，分离划线于3个麦康凯平板上，36℃，24h；可疑菌落为在平板上呈凸起、边缘整齐、无色的较大菌落；然后挑出不少于30个的可疑无色菌落，每一个单个可疑无色菌落的二分之一作为PCR反应模板检测eae基因；且每一个单个可疑无色菌落的另二分之一用于后续纯培养；4)接种eae阳性单菌落于营养琼脂平板36℃纯培养24h，纯培养物分别接种于木糖和乳糖发酵管，并用软琼脂检测动力，36℃培养，24h后观察结果；5)将上述eae基因阳性、不发酵乳糖、不发酵木糖、动力阴性的菌落作为疑似艾伯特埃希菌；无菌接种环挑取少量纯培养物菌苔于含有500μl去离子水的1.5ml离心管中重悬，煮沸10min，12000rpm离心3min，取上清液做PCR模板，用于后续的诊断性三重PCR鉴定、16SrDNA序列分析及MLST分析。