[发明专利]一种动物角膜长期培养评价眼刺激性损伤及修复的方法

摘要

一种利用动物离体角膜长期培养模型评价眼刺激性损伤及修复作用评估的方法，包括以下步骤：1.离体角膜制备；2.角膜长期培养；3.角膜化学损伤模型及评价；4.角膜物理损伤模型及评价；5.角膜损伤后修复作用评估；6.统计分析与结果判定。本发明利用外源刺激物，如化学物质、紫外线引起可逆性的角膜上皮细胞变性和基质损伤，通过预测模型，评估眼刺激性的程度；或者是利用化学方法、物理方法或机械方法造成角膜上皮细胞和基质的可逆性刺激、轻微磨损或缺失损伤，评估损伤后角膜的自身修复，或者损伤发生后添加药物评价药物促进角膜修复作用的方法。本方法操作简单，与体内实验相关性好，敏感程度高，能满足角膜刺激性损伤及其修复的检测和研究的需要。

主权项

一种利用动物离体角膜长期培养模型评价眼刺激性损伤及修复作用评估的方法，其特征是包括以下步骤：步骤1.离体角膜制备；步骤2.角膜长期培养：取清洗干净的角膜，上皮面朝下悬浮于添加有HBSS液的6孔板、12孔板或直径35mm的培养皿，使角膜完全浸没于培养液；将融解状态的0.5‑5％的琼脂‑明胶‑M199混合物,缓慢逐滴每次2‑3滴加入角膜窝内皮面，直至内皮窝完全填满，琼脂‑明胶在室温下完全凝固；将充满凝固的琼脂‑明胶的角膜倒置，转移到若干35mm培养皿中；吸取40‑60ml的M199培养基加入每个培养皿中，直到覆盖角膜缘，裸露角膜上皮面暴露于空气中；将培养皿置于小型振荡器上，置于32℃±2℃、5％CO2、90％相对湿度的培养箱中培养8‑24h，小型振荡器应使培养皿在每2h‑3h内从水平位置摇动到45°角，使得角膜可以短暂浸泡在培养基中浸润上皮组织；步骤3.角膜化学损伤模型及评价；步骤4.角膜物理损伤模型及评价；步骤5.角膜损伤后修复作用评估：(1)化合物损伤角膜后，将角膜转移到新的培养皿中，取40ml新的M199培养基加入每个培养皿中，后孵育2小时；更换含有活性物质表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子或维生素的M199培养基，置于32℃±2℃、5％CO2、90％相对湿度的培养箱，按步骤2角膜长期培养方法继续培养至第14天；实验组平行样20‑30个；含活性物质的M199培养基为活性修复组，不含活性物质的M199培养基为自然修复组，同时设空白对照；必要时设置基准对照；(2)培养期间，每2天更换含活性物质的M199培养液；分别于化学损伤后的第2h、14h、26h、38h、50h、62h、74h、86h、98h、110、170h和14d±2h等时间点，取培养液进行细胞因子测试，并取实验组其中2‑3只角膜进行浊度测试、电阻测试、荧光素留评分和组织学观察，其余角膜继续培养；(3)角膜液细胞因子测试：在更换新的培养液前，从培养皿中移出培养液，检测培养液中的炎性因子和修复因子水平：包括IL‑1a、IL‑6、IL‑8；(4)浊度变化：浊度检测前，从培养皿中取出角膜，将其固定于夹持器中，夹持器的后室和前室分别依次填充无菌不含酚红的MEM培养基，用角膜浊度仪测量并记录每个角膜的浊度值，来自不同组的角膜分别记录浊度值，OP活性h，OP修复h，OP空白；计算实验组与空白组的浊度差值；(5)电阻测定和荧光素观察：测完浊度后，用电阻仪测定角膜的电阻值；然后从夹持器中取下角膜，上表面滴入含2％荧光素钠(NaFL)的PBS；过量的NaFL立即用PBS冲洗，在紫外灯下观察NaFl的潴留，潴留的程度表明角膜损伤的严重性；计算潴留面积S占整个角膜面积C的百分比值，根据S/C值对损伤/恢复程度进行评分；0分：<2％，1分：2～25％，2分：26～50％，3分：51～75％，4分：76％～100％；(6)组织学评价：荧光素评分完成后，取角膜加入10％中和福尔马林缓冲液中固定24h；石蜡包埋、切片、取部分切片进行HE染色；显微镜下观察并评估组织学变化；取部分切片进行免疫组化染色：角膜上皮细胞紧密连接蛋白Occludin或ZO‑1的染色或钙粘连蛋白染色，用于观察角膜修复过程中，上皮屏障功能的改善情况；步骤6.统计分析与结果判定将上述步骤获得的各组实验数据，以均数±标准差表示，采用SPSS22.0统计软件进行分析，多组之间差异的比较用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK检验法，显著性水平α＝0.05，P＜0.05表示差异具有统计学意义；化学损伤后修复综合分析角膜电阻值、荧光素染色、浊度测试、炎性因子检测和组织学观察结果；机械损伤修复不进行电阻测试和浊度测试；紫外线损伤后修复参考化学损伤；根据不同检测参数的意义，从统计结果分析，作出修复作用的综合判断：(1)电阻测定和荧光素染色：随着培养时间的延长，自然修复组和活性修复组电阻值逐渐升高；荧光素染色的S/C的比值逐渐下降，评分降低；自然修复组和活性修复组与空白对照相比，S/C的比值具有统计学差异p＜0.05；活性修复组与自然修复组相比，电阻值的增高具有统计学意义，荧光素滞留的评分值相差1级和1级以上，认为活性物质对修复有促进作用；(2)浊度测试：随着培养时间的延长，自然修复组和活性修复组浊度(OP)的值逐渐下降；修复组与空白对照相比的浊度差值逐渐缩小；活性修复组与自然修复组相比，至少在2个和2个时间点以上，浊度差值相比具有统计学差异p＜0.05，认为活性物质对修复有促进作用；(3)炎性因子检测：随着培养时间的延长，自然修复组和活性修复组炎性因子的数值应呈下降或升高趋势，且具有统计学差异p＜0.05；同一时间下，活性修复组与自然修复组相比，特征性炎性因子或修复因子的水平具有统计学差异，提示活性物质对修复有促进作用；(4)组织学观察：通过HE染色和免疫组化染色，观察角膜的组织学变化，并详细记录：角膜化学刺激性损伤发生后，组织学表现为上皮的明显缺损，上皮细胞缺失、通透性增加，紧密连接蛋白ZO‑1、Occludin结构消失；随时间推移，上皮细胞增殖并向缺损处迁徙，其通透性逐渐降低，紧密连接蛋白结构逐渐形成；24h时，上皮细胞覆盖角膜上皮缺损处，但其通透性仍较正常组高，其细胞间紧密连接松散、排列紊乱；48h后，角膜通透性恢复正常，其角膜上皮细胞连接紧密，细胞间形成紧密连接结构；如果促进修复组与自然修复组相比，组织学修复时间缩短12h以上或修复程度提高，即相似组织学结构和特征观察的时间提前12小时以上，提示活性物质对修复有促进作用。