[发明专利]一种以薄荷节间茎段为外植体的遗传转化方法

摘要

本发明公开一种以薄荷节间茎段为外植体的遗传转化方法，包括下述步骤：步骤1，农杆菌菌株的活化培养；步骤2，薄荷无菌苗的获得；步骤3，薄荷节间茎段的预培养，步骤4，薄荷节间的遗传转化；步骤5，抗性芽的快速增殖。采用本方法成功实现了薄荷茎段的遗传转化，获得了稳定遗传和快速生长的转基因阳性植株。

主权项

1.一种以薄荷节间茎段为外植体的遗传转化体系方法，其特征在于包括以下步骤：步骤1，根癌农杆菌菌株的活化培养：将农杆菌在YEB固体培养基上划线后，放在26～30℃的温度条件下进行暗培养24～36h后，挑取单菌落接入YEB液体培养基中，并于25～30℃振荡培养1～2天后，用于外植体浸染；所述的农杆菌为根癌农杆菌LBA4404或EHA105，浸染薄荷节间茎段的菌液OD600＝0 .5～0.8；步骤2，薄荷无菌苗的获得：将薄荷茎尖用75％的酒精消毒20～40s，再用0 .1％升汞消毒5～10min，无菌水冲洗2～5次后，将消毒后的茎尖，剥去最外层2‑3片叶子后接种在MS+6‑BA 0 .5～2mg·L‑1+NAA0 .1～0.5mg·L‑1+蔗糖20～50g·L‑1+琼脂3 .5～4 .5g·L‑1的培养基上，并在22～28℃，光强1000～2000lx ,每天光照8～12h的条件下培养，获得薄荷离体；步骤3，薄荷茎段的预培养：切取薄荷无菌苗第2‑4节不带节的节间茎段作为外植体，接种于预培养基上，并进行预培养，预培养基是MS+6‑BA 0 .5～2mg•L‑1+NAA0 .1～0.5mg•L‑1+蔗糖20～50g•L‑1+琼脂3 .5～4 .5g•L‑1，薄荷茎段的预培养条件是在18～22℃、无光照条件下进行；步骤4，薄荷节间茎段遗传转化：选取预培养后的薄荷节间茎段切口处产生膨大的外植体放入步骤1活化好的农杆菌菌液中浸染5～10分钟，使外植体与农杆菌充分接触后，并用无菌滤纸吸干外植体表面多余的菌液后，再转入共培养基中，在18～24℃的暗培养条件下进行1～3d，共培养基为MS +蔗糖10～15g·L‑1+琼脂5～7.0g·L‑1；把共培养后的外植体转入筛选培养基为MS+TDZ 0 .5～4.0mg·L‑1+ IAA0.2～0.5 mg·L‑1+10~25%椰汁+琼脂5～7g·L‑1+蔗糖15～30g·L‑1+头孢霉素200～500mg·L‑1+5～10mg·L‑1潮霉素或30~50mg·L‑1卡那霉素进行筛选培养，直到抗性芽再生；步骤5，抗性芽快速增殖：切取长度为1 .5～3cm的抗性芽转接至速增殖培养基为MS+BA 0 .1～2.0mg·L‑1+蔗糖10～20g·L‑1+头孢霉素200～500mg·L‑1+琼脂5～7g·L‑1+蔗糖15～30g·L‑1，培养条件为温度25 ℃，光照时间8~10 h，光照强度1500~2000 lx。