[发明专利]一种酶性DNA机器用于miRNA检测的方法

摘要

本专利为分析microRNA (miRNA)的浓度荧光构建了一个通过依赖锌离子连接作为扩增生物催化剂的脱氧核酶的传感平台。该平台是基于目标miRNA诱导连接两亚基底物并且通过连接产物打开信标发夹探针，打开发夹激发荧光基团，通过检测荧光信号的强弱来确定目标物的浓度。本方法包括测定荧光光谱溶液的制备—形成再生脱氧核酶—第一扩增步骤—第二扩增步骤—目标物含量的测定五个步骤。本方法通过引入辅助核酸与剪切酶大大提高了荧光强度，从而降低了系统的检测限而且检测成本低、灵敏度高。miRNA的检测对生物功能的研究及以疾病诊断都有重要意义。

主权项

一种酶性DNA机器用于miRNA检测的方法，其特征是包括以下步骤：1.1测定荧光光谱溶液的制备所有的检测都在包含100 nM 氯化钠10 nM的氯化镁的10 nM 4‑(2‑羟乙基)N‑2‑羟乙基哌嗪‑N'‑2‑乙磺酸钠盐缓冲剂(pH=7.0)中进行；工作溶液包括0.5 μM的脱氧核酶亚基(4)和(5)，1 μM 底物亚基(2)和(3)，发夹探针的0.5 μM (8)，1 mM 锌离子，再加入不同浓度的目标miRNA，混合溶液继续培育扩增1.5小时在25 °C的环境下，各样品的体积均为20 μL，连接后，样品被稀释到50 μL；其中底物(2)需要用咪唑(pH=6.0，用HCl调节)、EDC·HCl修饰；方法：40 μL 10 μM的底物(2)与5 μL 0.1 μM咪唑和5 μL 0.1 μM EDC·HCl，25 °C培养2小时，再利用色谱分析柱(G‑25)纯化底物；1.2形成再生脱氧核酶脱氧核酶序列(4)与改良咪唑底物亚基(2)和羟基化的亚基(3)结合，在锌离子的存在下连接到3′和5′各自底物亚基的末端；通过发夹域连接脱氧核酶是稳定的，包括亚基(4)与底物亚基(2)脱氧核酶序列的一部分结合； 脱氧核酶(5)脱氧核酶的第二段序列，结构域(I)的一个扩展的发夹结构域(II)；得到结合第二个底物亚基(3)的核酸(5)；在分析物(1)的存在下，发夹结构域(II)打开，使2个脱氧核酶和底物亚基(4)/(2)和(5)/(3)自组装在一起；在锌离子的存在下，脱氧核酶是有活性的，导致连接亚基(2)和(3)形成连接产品(7)；1.3第一扩增步骤在步骤1.2基础上引入一个“辅助”的核酸(6)，“辅助”核酸(6)与锌离子连接脱氧核酶亚基形成的一个更稳定的结构；由连接产物与锌离子脱氧核酶亚基和(7)/(8)双相组成的连接产物打开发夹；将连接物(7)从锌离子脱氧核酶亚基中的催化分离，“辅助”核酸(6)与锌离子连接脱氧核酶亚基互补；由于“辅助”核酸(6)和脱氧核酶单位之间的稳定双相结构，链置换过程，导致形成“M”结构并且释放原本没有产生荧光信号的连接产品，连接产品再打开发夹(8)，产生荧光；1.4第二扩增步骤混合物由连接产物(7)和脱氧核酶亚基之间双工结构组成，并且在(8)和连接产物(7)之间形成的双工结构是受Nt.BspQI切口酶的影响，Nt.BspQI切口酶切割在(7)/(8)的复式结构中(8)的单链区域；这导致分离为淬灭剂标记的核酸片段(9)，荧光标记片段(10)，和再生连接产品(7)，进一步打开发夹结构(8)；这是切割复式结构(7)/(8)再生连接产物，从而循环打开发夹(8)和催化再生荧光标记片段(10)，通过Nt.BspQI切割酶介导再生连接产物；1.5目标物含量的测定目标物的浓度在0‑20 nM的范围内符合方程y=916.65+21.46x，R=0.79686；目标物的浓度在20‑200 nM的范围内符合方程y=1225.96+4.18x，R=0.99492；由这两个方程我们可以利用荧光信号的强度来计算溶液中目标物的含量。