[发明专利]适用于FFPE样品的基因表达定量的实时定量PCR方法

摘要

本发明涉及核酸分子定量的方法，具体而言，涉及适用于石蜡组织切片(FFPE)样品的基因表达定量的实时定量PCR方法，该方法包括1)反转录反应阶段；2)预扩增反应阶段；和3)巢式内扩增qPCR反应阶段。与传统的反转录qPCR相比，本发明的方法即保证了反转录、qPCR反应的特异性，又降低了反应所需底物的浓度，可以使qPCR的检测灵敏度提高500倍以上，尤其适用于低质量和/或低浓度的石蜡组织切片提取的mRNA的定量检测。本发明的方法可以极大地提高此类检测的灵敏度和可靠度。

主权项

一种实时定量PCR方法，特别是适用于FFPE样品的基因表达定量的实时定量PCR方法，包括：1)反转录反应：使用待检测的mRNA(特别是来自FFPE样品的mRNA)片段作为模板，通过反转录引物，在反转录酶的作用下自模板的3'端向5'端进行延伸反应合成5‘端具有稳定的茎‑环结构的第一链cDNA，其中，所述反转录引物是具有热稳定的茎‑环结构的DNA单链，该茎‑环结构由三个结构区域构成：i)3'端特异性底物结合区域，其可以匹配结合在底物mRNA上的退火区域，优选由8‑15个碱基构成，更优选由10‑12个碱基构成；ii)茎结构区域，其为由两个碱基数目和碱基序列完全互补匹配的DNA序列构成的双链稳定结构，优选由6‑12个碱基构成；和iii)环结构区域，其序列位于形成茎结构的两段DNA序列之间，优选由18‑25个碱基构成，其不与i)区域和ii)区域形成任何形式的稳定的匹配双链结构；2)外扩增PCR反应：以反转录反应获得的第一链cDNA为模板，通过5'端基因特异性引物和3'端通用外扩增引物，在DNA聚合酶作用下进行扩增反应以得到外扩增产物，其中，所述5'端基因特异性引物与第一链cDNA的3'端相匹配，同时也是下一步巢式内扩增qPCR反应的5'端基因特异性引物；所述3'端通用外扩增引物的序列与步骤1)中反转录引物的环结构区域一致；3)巢式内扩增qPCR反应：以5'端基因特异性引物和3'端基因特异性引物为扩增引物，以外扩增产物为模板，在DNA聚合酶作用下进行内扩增PCR反应，其中，所述5'端基因特异性引物与步骤2)中的5'端基因特异性引物相同，所述3'端基因特异性引物位于外扩增PCR 3‘端通用引物的下游，基因特异性匹配底物序列。