[发明专利]一种悬浮驯化293T细胞的方法

摘要

本发明提供了一种制备低血清培养的悬浮293T细胞系的方法，该方法包括：(1)复苏并培养哺乳动物细胞，得到贴壁培养的该293T细胞，用胰酶消化；(2)用添加了一定量血清的无血清培养基培养该贴壁培养的293T细胞，连续培养该293T细胞至适应该添加了一定量血清的无血清培养基；以及(3)重复步骤(2)中的该连续培育程序，逐渐降低该无血清培养基中的血清添加量至血清浓度为0，得到该悬浮培养的293T细胞。本发明操作简单，方便使用，费用低，安全性好。293T细胞悬浮培养的体外扩增培养方法无需特殊设备，操作简单可行。293T细胞悬浮培养的基础研究及临床应用上将具有广泛的前景。

主权项

1.全悬浮培养型293T细胞系的驯化方法，其特征在于：步骤如下：(1)贴壁培养型293T细胞的培养选用经无菌、支原体、外源病毒检定为阴性，贴壁培养型293T细胞，待细胞生长致密单层后用含10％胎牛血清的DMEM培养液按1：3比例分瓶传代，置37℃5％CO2的培养箱培养，在48‑72h内细胞形成致密单层，为边缘清晰的扁平上皮型细胞且细胞生长正常的情况下可用于驯化；(2)低血清贴壁培养型293T细胞系的驯化a)将步骤(1)所述生长正常的贴壁培养型293T细胞分别用含胎牛血清10％的DMEM培养液各培养三代；每次传代的标准是按1：4比例分瓶，在37℃5％CO2培养，在48‑72h内细胞形成致密单层；b)将培养液换成Free style培养基后加10％胎牛血清继续培养三代，传代标准同步骤a)；c)培养液中胎牛血清降为5％，按b步骤中的方法，传代比例降为1：3再培养三代；d)培养液中胎牛牛血清降为2％，在培养液中再加体积百分含量20％上一代次培养了该细胞48‑72h的培养液继续培养三代；传代标准同步骤c)；细胞在48h‑72h内形成致密单层，驯化得到了低血清贴壁培养型293T细胞系；(3)低血清全悬浮培养型293T细胞的驯化a)将步骤(2)驯化的低血清贴壁培养型293T细胞，用Free style无血清培养基按体积比1：1比例混合后，加2％胎牛血清制成培养液，用培养液将细胞密度调整至2‑5×105/ml，125r/min、37℃5％CO2摇床培养；b)重复步骤a)，每培养三代降低血清浓度，胎牛血清浓度依次从2％到1％到0.5％；b)每培养48h取样计数，细胞密度未达到1×106/ml时，800‑1000r/min离心后换用新鲜培养液重新悬浮培养；细胞密度达到1×106/ml时，800‑1000r/min离心按1：2比例分瓶培养；至细胞密度达到2×106/ml时，800‑1000r/min离心按1：3比例分瓶培养；在连续三代按1：3比例培养48h细胞密度均达2×106/ml时，驯化得到低血清全悬浮培养型293T细胞系；(4)无血清全悬浮培养型293T细胞的驯化a)在无血清培养基中加0.2％胎牛血清，将步骤(3)中得到的低血清全悬浮培养型293T细胞直接稀释到密度5×105/ml，置125r/min、37℃5％CO2摇床培养；b)每培养24h取样计数，细胞密度达到3×106/ml时，将细胞悬液直接稀释至5×105/ml接种培养，血清降为0，完全用无血清培养培养，在连续三代培养48h细胞密度均达3×106/ml时，驯化得到无血清全悬浮培养型293T细胞系。