[发明专利]一种利用农杆菌浸染法致使白花兜兰基因转变的方法

摘要

本发明公开了一种利用农杆菌浸染法致使白花兜兰基因转变的方法，包括以下步骤白花兜兰液体培养基的配制—白花兜兰固体培养基的配制—农杆菌液体浸染液的配制—白花兜兰浸染—白花兜兰暗培养—白花兜兰光照培养—结果检测。本发明利用白花兜兰最敏感的农杆菌LBA4404作浸染基质，成功实现了白花兜兰基因转变技术，第一次公开了白花兜兰基因转变的方法，并且本发明公开的白花兜兰转基因技术操作简便，结果具有可重复性，为白花兜兰的基因工程育种、遗传学、分子生物学研究提供了方便、快速、高效的理论基础和实验导入方法，为进一步通过转基因技术改造白花兜兰奠定了技术基础，值得推广。

主权项

一种利用农杆菌浸染法致使白花兜兰基因转变的方法，其特征在于，包括以下步骤：a、白花兜兰液体培养基的配制：向1L玻璃容器中加入去离子水900ml，松树皮粉末90g，磷肥5g，钾肥3g，氮肥2g，摇动容器直至磷肥、钾肥、氮肥完全溶解，松树皮粉末均匀悬浮在水中，再加入离子水定容至1L，在15psi高压下蒸汽灭菌20min，制得白花兜兰液体培养基；b、白花兜兰固体培养基的配制：向1L玻璃容器中加入去离子水900ml，松树皮粉末90g，磷肥5g，钾肥3g，氮肥2g，摇动容器直至磷肥、钾肥、氮肥完全溶解，松树皮粉末均匀悬浮在水中，加入离子水定容至1L，再加入150g琼脂粉，搅拌均匀，于15psi高压下蒸汽灭菌20min后，置于冷水浴中，待培养基温度降到室温时加入500mg头孢氨苄毒素，充分摇匀，将培养基倒入培养皿后，打开盖子，在紫外光照下光照15分钟后用封口胶封边，倒置，于4℃下保存；c、农杆菌液体浸染液的配制；将带有基因转变质粒的农杆菌LBA4404培养至OD＝0.6～1.0，于5000r/min的离心机中离心5min，弃上清液，用100mg/L乙酰丁香酮的LB液体培养基悬浮沉淀，室温下静置3h，于5000r/min的离心机中离心5min，弃上清，用白花兜兰液体培养基悬浮沉淀，制得农杆菌液体浸染液；d、白花兜兰浸染：选择生长良好、无病变的白花兜兰幼苗，灭菌，剪去茎尖和根部，置于农杆菌液体浸染液中浸泡10～20min，每隔2min摇匀一次；e、白花兜兰暗培养：将上述浸泡后的白花兜兰幼苗挑出浸染液，用灭菌后的滤纸擦干表层液体，置于白花兜兰固体培养基中暗培养3天；f、白花兜兰光照培养：将上述暗培养3天后的白花兜兰幼苗用500mg/L的头孢氨苄毒素清洗3遍，再用灭菌水冲洗5遍，最后用灭菌后的滤纸擦干后放到含有500mg/L的头孢氨苄毒素的白花兜兰固体培养基中进行光照培养；g、结果检测：将浸染并培养两周后的白花兜兰用X‑Gluc染色液在37℃恒温箱中浸泡3h，取出后用酒精脱色处理，能够产生肉眼可见的深蓝色化合物。