[发明专利]马铃薯四倍体栽培种与二倍体野生种原生质体融合方法

摘要

本发明公开了一种马铃薯四倍体栽培种与二倍体野生种原生质体融合方法，通过采用酶解法、界面法分离和纯化马铃薯原生质体，聚乙二醇(PEG)诱导融合法融合四倍体和二倍体原生质体，摸索、优化获得了一套最优的针对参试马铃薯原生质体分离纯化条件、原生质体培养基、愈伤组织再生培养基、四倍体与二倍体原生质体融合方法。并在使用该方法进行的费乌瑞它和野生二倍体材料(E12、E25)融合实验中，得到经DNA进行SRAP分子标记检测的融合株系2个和融合愈伤组织4个；这些材料可作为后续实验材料使用，以确定所获得的融合株系在农艺性状的变化及在生产上的可能应用。

主权项

马铃薯四倍体栽培种与二倍体野生种原生质体融合方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、选择光照充足条件下培养2‑3周的马铃薯组培苗叶片，在无菌条件下，将马铃薯组培苗叶片切划后，叶片正面朝下浸于酶解液内，26℃暗条件静置温育16‑18h；酶解消化结束后，轻轻晃动培养皿，使原生质体从已酶解消化的叶片中释放到酶解液中；100目尼龙过滤网过滤后，将包含原生质体的酶解液转入无菌离心管中进行分离纯化，得待融合的马铃薯原生质体；S2、将所得的马铃薯原生质体分别漂洗后，再用漂洗液重悬并调整稀释至33.5×104个/ml后，将两种原生质体等体积混合均匀；然后用移液器取等分量的800ul分别移至直径5cm的培养皿中，并静置5‑10min；使原生质体粘附在培养皿底部；S3、用移液器吸取PEG溶液，并滴加4‑5滴到原生质体混合液上，确保PEG都覆盖粘附在底部原生质体；静置温育10‑15min，随后，将培养皿倾斜45度，此时，原生质体依然粘附在培养皿底部，而PEG混合液流往皿边，再用移液器吸取PEG混合液干净；S4、用漂洗液漂洗粘附在培养皿底部的融合原生质体，倾斜培养皿后去除漂洗液；重复漂洗一次；S5、往培养皿中轻轻加入5ml改良KM培养基，用parafilm封口胶密封好培养皿；并置26℃条件下暗培养7天，随后转到光照12h/天培养箱中静置培养；S6、培养20天后，用稀释培养基稀释10倍后，转移到直径9‑10cm的培养皿中继续培养，培养条件为光照12h/天，26℃的培养箱；S7、培养4‑5周后，把生成的单个愈伤组织转接到愈伤组织再生培养基中，大约5周后，愈伤会可能分化形成新植株。