[发明专利]PD-1基因缺陷型T淋巴细胞制剂的制备方法

摘要

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种PD‑1基因缺陷型T淋巴细胞制剂的制备方法。PD‑1敲除载体的构建，T淋巴细胞分离与激活，电转染T淋巴细胞及T7E1酶切鉴定，流式细胞仪筛选与测序分析。本发明的基因缺陷型免疫细胞制剂的生产，一方面简化了细胞的生产程序，另一方面提升了制剂获得的速度。 1

主权项

1.一种PD‑1基因缺陷型T淋巴细胞制剂的制备方法，其特征在于步骤如下：

（1）PD‑1敲除载体的构建

根据PD‑1全基因序列设计两个不同的gRNA target序列，然后将两个不同的gRNA target序列克隆进表达载体，获得带有两个不同target序列gRNA的敲除载体；

两个不同的gRNA target序列分别为5’‑TGTGAGGAGTGGATAGGCCA‑3’和5’‑AGGGCCCGGCGCAATGACAG‑3’；

（2）T淋巴细胞分离与激活

T淋巴细胞分离，培养，激活，繁殖，收集；

（3）电转染T淋巴细胞及T7E1酶切鉴定

T淋巴细胞中加入电转液和步骤（1）得到的敲除载体进行电转染，电转染结束后，继续培养，收集细胞提取基因组，采用T7E1酶切鉴定；

步骤（3）中所述的电转液组成如下，以体积百分比计：

无钙镁PBS               90%

无血清培养基RPMI 1640   10%；

以无钙镁PBS 和无血清培养基RPMI 1640的总体积为100%计，EDTA加入量为30g/L，蔗糖加入量为200mmol/L；

（4）流式细胞仪筛选与测序分析

电转染结束后收集的细胞采用流式细胞仪进行分离，分离所得细胞扩大培养，即得PD‑1基因缺陷型T淋巴细胞制剂；扩大培养后的细胞提取基因组进行测序分析；

步骤（4）获得高有效移码突变的群体免疫细胞制剂。

2.根据权利要求1所述的PD‑1基因缺陷型T淋巴细胞制剂的制备方法，其特征在于步骤（3）中所述的继续培养时间为48h。