[发明专利]一种使用温和噬菌体载体包装CRISPR-Cas9系统的方法有效
| 申请号： | 201710688906.0 | 申请日： | 2017-08-13 |
| 公开（公告）号： | CN107365804B | 公开（公告）日： | 2019-12-20 |
| 发明（设计）人： | 宋宏彬;邱少富;刘鸿博;李浩;梁媛;杨超杰;赵荣涛;贾雷立;李鹏;王立贵 | 申请（专利权）人： | 中国人民解放军疾病预防控制所 |
| 主分类号： | C12N15/90 | 分类号： | C12N15/90;C12N9/22 |
| 代理公司： | 11478 北京市众天律师事务所 | 代理人： | 李新军 |
| 地址： | 100071*** | 国省代码： | 北京;11 |
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| 摘要： | 本发明公开了一种使用温和噬菌体载体包装CRISPR‑Cas9系统的方法，所述方法包括：(1)将自杀基因、与特异性gRNA结合的靶点序列、以及下游的PAM序列构建到pST | ||
| 搜索关键词： | 温和噬菌体 同源重组 宿主菌 自杀基因 酶类 质粒 诱导 大肠杆菌宿主菌 染色体整合 噬菌体序列 噬菌体载体 靶点序列 二次重组 技术支持 抗性标记 模板双链 系统对抗 线性片段 序列构建 序列重组 载体包装 质粒转化 耐药菌 同源臂 省略 裂解 转化 删除 筛选 携带 收获 | ||
【主权项】：
1.一种使用大肠杆菌λ样温和噬菌体载体包装CRISPR-Cas9系统的方法，所述方法包括以下步骤：/n(1)将自杀基因SacB与CRISPR-Cas9系统中特异性gRNA结合的靶点序列、以及下游的PAM序列构建到带有抗生素抗性基因的质粒中；/n(2)将步骤(1)获得的质粒转化入染色体整合有大肠杆菌λ样温和噬菌体的大肠杆菌宿主菌中，所述宿主菌中还转化有能够表达同源重组相关酶类的质粒；/n(3)将两端携带噬菌体序列同源臂的CRISPR-Cas9序列重组模板双链DNA线性片段转化入所述宿主菌中；/n(4)诱导同源重组相关酶类和自杀基因SacB表达；/n(5)筛选发生了同源重组的宿主菌；/n(6)诱导温和噬菌体裂解宿主菌，收获发生重组的包装了CRISPR-Cas9系统的温和噬菌体。/n
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