[发明专利]应用二代测序技术分析牙髓干细胞与根尖牙乳头干细胞差异miRNAs表达谱的方法

摘要

本发明提供一种应用二代测序技术分析牙髓干细胞与根尖牙乳头干细胞差异miRNAs表达谱的方法，制备牙髓干细胞和根尖牙乳头干细胞的单细胞悬液，从单细胞悬液中分选对数生长期的细胞，并采用STRO‑1‑PE标记，经免疫磁珠分选收集STRO‑1阳性细胞即为所需的牙髓干细胞和根尖牙乳头干细胞，经RNA提取，然后应用二代测序技术检测两种干细胞miRNAs表达谱。本发明通过利用高通量的二代测序技术分析干细胞的miRNAs表达谱，对于检测牙髓干细胞与根尖牙乳头干细胞中的差异miRNAs表达谱，了解干细胞特性，具有深远的意义。

主权项

一种应用二代测序技术分析牙髓干细胞与根尖牙乳头干细胞差异miRNAs表达谱的方法，其特征在于：包括如下操作步骤：(1)培养牙髓干细胞和根尖牙乳头干细胞：选取新鲜拔除的第三磨牙，在无菌条件下取出牙髓、根尖牙乳头组织，将组织剪碎，并采用I型胶原酶及dispase酶于37℃下消化30min，之后离心重悬，用细胞筛过滤重悬液，获得单细胞悬液；(2)牙髓干细胞和根尖牙乳头干细胞的分选：对步骤(1)中获得的单细胞悬液，利用胰酶消化收集其中对数生长期的细胞，并依据抗体说明书采用鼠抗人STRO‑1‑PE标记细胞，经免疫磁珠分选收集STRO‑1阳性细胞，所收集到的STRO‑1阳性细胞即为所需的牙髓干细胞和根尖牙乳头干细胞；(3)二代测序技术检测细胞miRNAs表达谱：分别取步骤(2)经分选后的牙髓干细胞和根尖牙乳头干细胞，加入Trizol混合后抽提总RNA；使用TruSeq Small RNA Sample Prep Kit，按照厂家的标准流程，主要步骤如下：测定RNA的浓度、琼脂糖凝胶电泳检查RNA的完整性、以及测定RNA的RIN值，完成RNA样本质检后，使用接头对切胶回收的20‑40nt的miRNAs的3’与5’端进行连接，逆转录合成cDNA第一链，随后进行PCR扩增，PCR扩增产物经PAGE电泳质检、切胶纯化、浓度测定以及质检后，将浓度统一调整为2nM，miRNAs文库构建即告完成；待测miRNAs文库在cBot上完成簇类生长，然后将流通池转移到基因测序系统上，按照标准流程进行二代测序及数据分析。