[发明专利]一种重组毕赤酵母菌生产肝脏解毒酶的发酵生产工艺

摘要

本发明提供一种重组毕赤酵母菌生产肝脏解毒酶的发酵生产工艺，包括菌种准备、菌株活化、一级种子培养、二级种子培养、发酵培养和诱导表达以及放罐步骤。所述的菌种为含肝脏解毒酶基因的重组毕赤酵母菌。所述的发酵培养和诱导表达包括四个阶段，分别为菌体富集阶段、甘油补料发酵阶段、碳源饥饿阶段和高密度高溶氧诱导补料阶段。本发明通过重组毕赤酵母菌发酵生产的肝脏解毒酶的酶活达到50000‑56000 U/g，发酵时间为132‑144h。

主权项

1.一种重组毕赤酵母菌生产黄曲霉毒素解毒酶的发酵生产工艺，其特征在于：包括菌种准备、菌株活化、一级种子培养、二级种子培养、发酵培养和诱导表达以及放罐步骤；/n所述重组毕赤酵母菌的保藏号为CCTCC M2017278；/n所述的一级种子培养：挑取活化重组毕赤酵母菌，接种于培养基中，培养至培养液OD600=0.6～0.8后收集菌体；将菌体再次发酵，发酵温度为25℃±0.5℃，罐压是0.06MPa；培养至培养液OD600=1.5～1.8；/n所述的二级种子培养：接种比例为1%，温度控制在24～26℃，发酵液PH为6.5～7.0，溶氧含量控制为25%～35%；/n所述的发酵培养和诱导表达包括四个阶段，分别为菌体富集阶段、甘油补料发酵阶段、碳源饥饿阶段和高密度高溶氧诱导补料阶段；/n所述的发酵培养和诱导表达步骤：采用的发酵培养基的有效成分含量为：酵母膏10～30g/L、蛋白胨6.7～20g/L、生物素3.3～10ug/L、甘油23.3～70mL/L、K₂HPO₄ 5～15g/L、麦芽汁0～8 mL/L；/n所述的菌体富集阶段：通过反馈流加氨水的方式控制PH 6.5～7.0，空气通气比为0.6vvm，转速为120～160 r/min；发酵温度为25℃±0.5℃；罐压是0.05～0.07MPa，DO值为25～35%，培养12～14 h，本阶段菌体湿重达250g/L以上；/n所述的甘油补料发酵阶段：控制空气通气量调为1.4～1.6vvm，控制发酵温度25℃±0.5℃，罐压0.05～0.07MPa，DO值为25～35%，向发酵罐中流加30%甘油，甘油流加速度为17～20 mL·(h·L)^-1，甘油补料时间控制22～26 h，菌体OD600达到1.8～2.0；/n所述的碳源饥饿阶段：控制发酵罐内温度30℃±0.5℃，空气通气量为0.8～1.2vvm，罐压为0.05～0.07MPa，进行饥饿培养1～1.5h；/n所述的高密度高溶氧诱导补料阶段：流加甲醇和 50%山梨醇溶液1:1混合液；发酵温度控制为24～29℃，控制pH为5.5～7.1，空气通气量为0.8～1.2vvm，罐压为0.05～0.07MPa，DO值为25～35%。/n