[发明专利]区别4种短体线虫的PCR‑RFLP方法

摘要

本发明公开了区别4种短体线虫的PCR‑RFLP方法，通过DNA提取、以线虫核糖体28S基因D2‑D3区DNA序列为基础设计一对通用引物进行PCR扩增、再用4种限制性内切酶酶切及带谱鉴别，能明显区分咖啡短体线虫、卢斯短体线虫、穿刺短体线虫和伤残短体线虫，结果稳定，操作简单，在植物检疫和植物保护领域具有广泛应用前景。

主权项

区别4种短体线虫的PCR‑RFLP方法，其特征在于步骤如下：a、DNA提取：将目标短体属线虫挑入内有双蒸水10μl的PCR管中，放入超低温冰箱‑80℃下保存29～31min，取出后立即在85℃条件下恒温5 min，再立即将PCR管的温度速降至56℃，恒温30S，在PCR管中加入浓度为1mg/mL的蛋白酶K溶液2μl和10×EasyTaq缓冲液5μl，PCR管先在56℃下恒温1 h，再在95℃条件下恒温15min，得到DNA提取液，‑20℃保存备用；b、PCR扩增： 50μl反应体系为2×Taq Master Mix 25μl, 双蒸水19μl、浓度为40μmol/L的上游引物2μl、浓度为40μmol/L的下游引物2μl，DNA提取液2μl；扩增反应条件为：94℃预变性4min；94℃变性30S，55℃退火30S，72℃延伸1min，共35个循环；最后一个循环结束后，72℃延伸10min，得到PCR产物；所述上游引物的核苷酸序列为：ACA AGT ACC GTG AGG GAA AGT TG，下游引物的核苷酸序列为：TCG GAA GGA ACC AGC TACT A；c、酶切反应：将上述PCR产物6μl、10×PCR 缓冲液1μl、去离子水2.5μl、限制性内切酶液0.5μl，置于PCR管中，放入PCR仪，37℃保温条件下酶切反应3h，然后进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下观察、拍照，获得PCR‑RFLP带谱；所述限制性内切酶液内含BsaWI酶、HincII酶、StuI酶和Hpy99I酶，琼脂糖凝胶电泳条件：10μl酶解液与2μl的6×上样缓冲液混匀，上样到用Gel red染色过的20％琼脂糖凝胶，于150V稳压下电泳，电泳缓冲液为1×TAE，电泳时间约为0.5 h；d、带谱鉴别：上述PCR‑RFLP带谱中，若StuI酶切带谱为472bp+301bp，可判断为伤残短体线虫；若StuI酶不酶切，BsaWI带谱为572bp+215bp, 则判断为卢斯短体线虫；若BsaWI酶不酶切， HincII酶带谱为620～635bp+158bp, 则判断为咖啡短体线虫；若HincII酶也不酶切，则判断为穿刺短体线虫。