[发明专利]一种基于氧化石墨烯的荧光传感器检测MMP-9的方法

摘要

一种基于氧化石墨烯的荧光传感器检测MMP‑9的方法，属于生物检测技术领域。本发明将中间含有MMP‑9切割位点的二肽DNA复合物与模板DNA两端互补的分子杂交，形成中间含有颈环结构的DNA双链，MMP‑9可在二肽处的位点进行酶切，使得颈环DNA延展成一条单链DNA片段。荧光标记的单链DNA与氧化石墨烯混合引起DNA荧光淬灭，将荧光淬灭体系与酶切后的DNA复合体系混合，荧光标记的DNA与延展出的单链DNA互补杂交形成双链DNA结构，淬灭的荧光得以恢复，根据MMP‑9的浓度和荧光强度的对应关系，可以实现MMP‑9检测。本方法操作简单方便、灵敏度高、特异性好，为实际样本的检测提供了一种可行的方法。

主权项

一种基于氧化石墨烯的荧光传感器检测MMP‑9的方法，其特征在于包括如下步骤：（1）氧化石墨烯的合成称取12g的K2S2O2和12g的P2O5加入到30mL浓硫酸溶液中，置于加热反应器上进行加热，当温度达到80℃时将5g石墨烯加入到浓硫酸溶液中进行反应，当溶液颜色变成深蓝色时停止加热，并将溶液冷却至室温；随后将溶液进行10倍稀释，并用0.22μm的滤膜进行过滤，除去大块的沉淀物收集滤液，然后置于80℃的条件下过夜干燥；将50mL的浓硫酸置于冰浴条件下冷却，随后加入2g前述处理的石墨烯氧化物，再加入10g的KMnO4，在冰浴中搅拌反应20min后，加入2g的NaNO3，在室温下搅拌反应2h，再加入500mL超纯水和30%的H2O2终止反应；得到的反应液用10%的HCl溶液洗涤后再用超纯水洗涤，随后再进行透析，将透析后的溶液进行超声剥离2h，最后将溶液在3000r/min的条件下进行离心除去离心管底部的沉淀，收集的上清液即为石墨烯氧化物；（2）带有MMP‑9切割位点的颈环杂交双链DNA的制备将含有MMP‑9切割位点的二肽DNA1偶联物以1.2:1的摩尔比与DNA2混合进行杂交反应，杂交缓冲液为pH8.0的0.05M Tris‑HCl缓冲液，二肽DNA1偶联物的终浓度为12nM，DNA2的终浓度为10nM，在室温下孵育0.5~2h后，得到带有MMP‑9切割位点的颈环杂交双链DNA结构；二肽DNA1偶联物：5’‑ACCGTAGCGT‑Gly‑Leu‑GGTCAACTGC‑3’；DNA2：5’‑GCAGTTGACC‑GTCTACCGTA‑ACGCTACGGT‑3’；（3）荧光信号的测定以及MMP‑9的检测取100μL步骤（1）合成的石墨烯氧化物用0.01M pH7.6的HEPES缓冲液进行10倍稀释，得到浓度为1mg/mL的石墨烯氧化物，然后加入荧光染料标记的DNA3使得DNA3的终浓度为10~20nM，在室温下孵育20~60min，得到石墨烯氧化物荧光标记DNA3的混合体系；将步骤（2）制备的双链DNA反应物分装到250μL PCR管中，每管50μL，在每管中分别加入浓度为0nM、0.1nM、0.5nM、1nM、2nM、5nM、10nM的MMP‑9，在室温下振荡反应0.5~2h后，加入50μL前述制备的石墨烯氧化物荧光标记DNA3的混合反应液组成反应终体系，在室温下孵育反应20~50min，测定每管的荧光信号强度；DNA3：5’‑TACGGTAGAC‑荧光染料‑3’。