[发明专利]一种草鱼肠巨噬细胞的分离、纯化与原代培养方法

摘要

本发明涉及一种草鱼肠巨噬细胞的分离、纯化与原代培养方法。分离方法为：无菌操作取出肠道中后段，除去肠道外脂肪与肠系膜，纵向剖开肠管清除粪便，使用无菌弯头镊子刮除草鱼肠黏液与上皮细胞层，刮除时间15min；将除去黏液和上皮细胞层的肠段处理成碎块置于胶原酶IV消化液中消化，获得固有层单细胞悬液；再用鱼类脏器单核细胞分离试剂盒分离肠巨噬细胞。纯化方法为：采用差异贴壁法纯化肠巨噬细胞。原代培养方法为：用含草鱼自体血清的RPMI 1640完全培养液培养肠巨噬细胞，待细胞贴壁后用含脂多糖的RPMI 1640完全培养液换液一次，以后每隔2天换液一次，细胞至少可存活20天。本发明建立了一种可操作性强、重复性好的草鱼肠巨噬细胞分离、纯化和原代培养方法。

主权项

1.一种草鱼肠巨噬细胞的分离方法，其特征在于包括以下步骤：S1、在无菌环境下，获得健康草鱼中后段肠道之后对所述肠道做预处理，所述预处理的操作为：将所述肠道外脂肪与肠系膜除去，纵向剖开肠管并清除粪便，之后刮除肠道黏液以及上皮细胞层，最后用PBS缓冲液振荡清洗，得到肠壁明显变薄且肠壁颜色变为淡黄色至白色的肠段；S2、将所述肠段充分处理成碎块，并加入到胶原酶IV消化液中进行振荡消化，消化结束后过滤得到滤液，将所述滤液进行离心处理获得细胞沉淀物，将所述细胞沉淀物配制成肠黏膜固有层单细胞悬液；S3、从所述肠黏膜固有层单细胞悬液中分离得到肠巨噬细胞；所述步骤S1中健康草鱼中后段肠道的获取操作为：用自来水冲洗健康草鱼的体表后敲打草鱼头部致死，立即放入75％乙醇中浸泡20s，取出肠道中后段；所述预处理在含有预冷的PBS缓冲液的培养皿中进行，肠段用PBS缓冲液振荡清洗3次，所述PBS缓冲液的浓度0.01mol/L，pH7.4；所述步骤S1中，采用无菌弯头镊子刮除肠黏液与上皮细胞层；所述步骤S2中碎块的体积＜1mm³，所述碎块置于胶原酶IV消化液中放入28℃振荡培养箱振荡消化2h，所述振荡培养箱的转速为250转/分钟；消化结束将所述胶原酶IV消化液过400目筛网获得滤液，之后将所述滤液以1800rpm离心8min并收集细胞沉淀物，使用Hank's平衡液洗涤所述细胞沉淀物，并使用所述Hank's平衡液将所述细胞沉淀物配成浓度为1×10⁸个/mL的肠黏膜固有层单细胞悬液；所述的胶原酶IV消化液由Hank’s平衡液、胎牛血清以及胶原酶IV组成，所述胎牛血清在胶原酶IV消化液中的质量浓度为1.7mg/mL，所述Hank’s平衡液在胶原酶IV消化液中的体积百分数为95％，所述胎牛血清在胶原酶IV消化液中的体积百分数为5％；步骤S3具体为：在15mL离心管中依次缓慢加入3mL分离液1，2mL分离液2，制成梯度界面；吸取5mL上述制好的单细胞悬液加在分离液液面上，1800rpm/min离心30min，此时离心管内容物被分为五层，由上而下依次是稀释液层、环状乳白色上层、环状乳白色下层、分离液层和红细胞层；用巴氏吸管小心吸取环状乳白色上层至另一15mL离心管中，用Hank's平衡液洗3次，1800rpm/min离心8min，弃上清，用1mL RPMI 1640基础培养液培养液重悬细胞沉淀；所述RPMI 1640基础培养液由RPMI 1640培养液、胎牛血清以及抗微生物液组成，所述RPMI 1640培养液、胎牛血清以及抗微生物液在RPMI 1640基础培养液中的体积百分数分别为94％、5％、1％。