[发明专利]一种诱导桃儿七体细胞胚发生的方法

摘要

本发明提供了一种诱导桃儿七体细胞胚发生的方法，涉及组织培养技术领域。包括以下操作步骤：(1)无菌试管苗的诱导；(2)胚性愈伤组织的分化；(3)体细胞胚的诱导；(4)体细胞胚的同步化调控及增殖培养，获得大量桃儿七体细胞胚丛生芽。本发明提供的方法得到的体细胞胚丛生芽诱导率达75％以上，再生种苗存活率达85％以上。本发明提供的方法操作工艺简单，不受时间、季节限制，可以在室内工厂化生产桃儿七体细胞胚再生种苗以供生产栽培需要。

主权项

1.一种诱导桃儿七体细胞胚发生的方法，包括以下步骤：将消毒后的桃儿七种子接种于种子培养基上进行暗培养5~7d，得到种胚，所述种子培养基为MS固体培养基，pH值为5.8；将步骤1）得到的种胚接种于幼苗诱导培养基上进行幼苗诱导培养32~37d，得桃儿七无菌苗，所述幼苗诱导培养基以MS固体培养基为基本培养基，包括5.0mg/L的GA3、20g/L的蔗糖和4.55g/L的琼脂，所述幼苗诱导培养基的pH值为5.6~5.8；所述幼苗诱导培养包括5~7天的暗培养和25~30天的光照培养；所述光照培养的光照强度为2000~3000lx，每天光照10~14h；切取步骤2）得到的所述桃儿七无菌苗的下胚轴作为外植体，接入愈伤组织诱导培养基上进行愈伤组织培养，培养19~21d得到愈伤组织；所述愈伤组织诱导培养基以MS固体培养基为基本培养基，包括1.0mg/L 的2,4‑D、1.0mg/L的KT、0.1~0.5mg/L 的NAA、4.55g/L的琼脂和30g/L的蔗糖，pH为5.6~5.8；将步骤3）得到的愈伤组织接种于胚性愈伤组织诱导培养基上进行愈伤组织胚性诱导培养40~50d，得到胚性愈伤组织；所述胚性愈伤组织诱导培养基以MS固体培养基为基本培养基，包括1.0mg/L 的6‑BA、1.0mg/L 的GA3、0.1mg/L 的IAA、300mg/L的水解酪蛋白、4.55g/L的琼脂和40g/L的蔗糖，pH值为5.6~6.2；将步骤4）得到的胚性愈伤组织破碎，接种于体细胞胚诱导培养基上进行体细胞诱导培养29~31d，得到体细胞胚材料；所述体细胞胚诱导培养基以MS液体培养基为基本培养基，包括0.5mg/L 的6‑BA、0.1mg/L 的GA3、0.1mg/L 的IAA、300mg/L的水解酪蛋白和40g/L的蔗糖，pH值为5.8；将步骤5）得到的体细胞胚材料接种于成熟化固体培养基上进行成熟培养12~14d，得到成熟化体细胞胚材料；所述成熟化固体培养基为以MS固体培养基为基本培养基，包括1.0mg/L 的ABA、300mg/L的水解酪蛋白、4.55g/L的琼脂和40g/L的蔗糖，pH值为5.8；将步骤6）得到的成熟化体细胞胚材料转入发育培养基上进行发育培养3~5d，得到发育的体细胞胚材料；所述发育培养基以MS固体培养基为基本培养基，包括20g/L的蔗糖和4.55g/L的琼脂；将步骤7）得到的发育的体细胞胚材料转入萌发培养基上进行萌发培养30d，得到发育状态相对一致的体细胞胚；所述萌发培养基以MS固体培养基为基本培养基，包括0.5mg/L 的6‑BA、0.1mg/L 的IAA、300mg/L的水解酪蛋白和40g/L的蔗糖，pH值为5.8。