[发明专利]一种小鼠胰腺内浸润的免疫细胞分离方法

摘要

一种小鼠胰腺内浸润的免疫细胞分离方。方法用胶原酶IV，DNA酶I和RPMI1640混合消化液消化胰腺组织后，通过100μm的尼龙滤网过滤，经过密度梯度离心，收集离心后中间层细胞，分析细胞获得率、存活率和细胞种类。结果每只小鼠可获取(3.0±1.2)x105个细胞；分离得到的细胞活率为(96.7±2.2)％；经流式细胞术分析，CD45阳性T细胞含量为(97.1±3.5)％，CD3阳性T细胞含量为(61.2±5.7)％，CD4阳性T细胞含量为(49.1±5.1)％，CD8阳性T细胞含量为(47.2±5.3)％，CD19阳性B细胞含量为(32.8±4.3)％。结论该方法简化、高效、稳定，且获取的细胞数量多、活率高、纯度高，可为分离胰腺浸润的免疫细胞相关研究提供可靠的方法。

主权项

一种小鼠胰腺内浸润的免疫细胞分离方法，包括如下步骤：(1)胰腺组织块的准备：处死小鼠，取出胰腺，置于4℃装有磷酸盐缓冲溶液的3.5cm直径放置于冰上的培养皿，用磷酸盐缓冲溶液清洗1‑2次，移至新的3.5cm培养皿中，根据需要剪碎至1mm2的均匀体积块；(2)胰腺组织块分离和消化：将剪碎的胰腺组织块中放入0.5mg/ml胶原酶IV和0.01mg/ml DNA酶I消化液中，置于37℃恒温摇床中消化1.5h后，取出，吸出消化液，过100μm的尼龙滤网到新的15ml离心管中，1500rpm/5min,收集细胞；(3)密度梯度离心：将4ml 80％的percoll溶液加入到15ml的离心管中，离心管倾斜60度，然后将用8ml 40％的percoll溶液重悬的细胞轻轻缓慢沿管壁加入流至80％的percoll溶液的液面之上，所述8ml 40％的percoll溶液由RPMI‑1640完全培养基稀释，两层液体间可见清晰的分界面；在25度、400g、25min、升速为1、降速为0的条件下离心；离心后可见分界面有一层模糊状的细胞；吸取最上层少许液体弃掉，吸分界面中间细胞层液体至新的15ml离心管中，加入磷酸盐缓冲溶液至15ml，上下颠倒混匀；离心，常温、1500rpm/5min，弃去上清液，用磷酸盐缓冲溶液重悬沉淀，即得所需细胞。