[发明专利]一种稻瘟病的生物防治方法

摘要

一种稻瘟病的生物防治方法，涉及水稻病虫害的生物防治技术领域，本发明的制备方法包括制备梯度稀释液、制备NA固体培养基、芽胞杆菌分离、制备LB液体培养液、制备粗提蛋白质液、水稻定殖。本发明分离得芽胞杆菌能够分泌抗菌物质来抑制病原菌生长，并诱导植物防御系统抵御病原菌入侵，供试菌株对稻瘟病菌分生抱子的萌发、芽管的延长和附着胞的形成具有显著的抑制作用，本发明的菌株活性物质对稻瘟病菌有较强的抑制作用，对稻瘟病菌菌丝生长抑制率达到80％以上。

主权项

一种稻瘟病的生物防治方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：选取健康水稻叶片，剪成5cm的叶段，放入装有质量浓度75％乙醇的三角瓶中振荡洗涤2次后倒掉乙醇，加入无菌水浸泡30min后梯度稀释，得梯度稀释液；步骤二：制备NA固体培养基，采用蛋白胨10.0g、牛肉粉3.0g、氯化钠5.0g、琼脂15.0g、葡萄糖2.5g，加蒸馏水溶解，定容至1L，PH调至7±0.1，分装后121℃灭菌20min；步骤三：吸取梯度稀释液涂布于NA固体培养基上，待吹干后，在30℃的恒温培养箱中倒置培养48h，挑取单菌落，在NA固体培养基上梯度划线再次获得单菌落，将获得的单菌落保存于NA固体培养基试管斜面备用；步骤四：制备LB液体培养液，在950ml去离子水中加入胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl10g，搅拌直至溶质溶解，用5mol/LNaOH调pH至7.0，用去离子水定容至1L，在15psi高压下蒸汽灭菌21min；步骤五：NA固体培养基试管斜面上挑取单菌落，接种于LB液体培养液中，在180rpm、37℃的条件下振荡培养48h，然后在4℃、10000rpm/min离心15min，去除菌体，保留上清液，取500mL上清液溶于500mL、饱和度为80％的(NH4)2SO4溶液中，放于4℃冰箱静置48h，析出絮凝状沉淀物，所述的絮凝状沉淀物再次在4℃，10000rpm/min离心15min，弃去上清液，保留沉淀物，用500mLPBS缓冲液悬浮沉淀物，并置于透析袋中透析过滤，析出物经过0.22um的细菌滤膜过滤，得到粗提蛋白质液；步骤六：水稻种子用质量浓度70％的乙醇溶液浸泡2min，然后用质量浓度3％的次氯酸钠水溶液浸泡30min，期间用玻璃棒搅动，无菌水冲洗3次，第3次冲洗持续10min，过夜干燥，置于铺有两层湿润滤纸片的培养皿中，再放于37℃恒温培养箱培养4d直至发芽，最后将发芽的水稻种子播种于田地，在水稻生长的第10、20、50和80天向水稻叶面喷洒粗提蛋白质液。