[发明专利]选择适配体的方法和利用差别亲和力的多重免疫分析

摘要

本发明提出了利用捕捉配体与目标分析物之间的结合对间的差别亲和力的多重免疫分析。描述了选择对目标分析物具有所需亲和力的适配体的窗口磁力辅助的快速适配体选择(窗口‑MARAS)方法，和通过利用所选适配体作为试剂中的捕捉配体来产生在一次分析中进行多重免疫分析或多重检测的试剂的方法，并且所述方法用于基于捕捉配体与目标分析物之间的结合对的差别亲和力，证实多重免疫分析的可行性。

主权项

1.一种选择适配体的方法，而所述适配体能够以差别亲和力与多个目标分析物结合，所述方法包括：a)提供具有多个寡核苷酸的随机序列库；b)准备多个与阴性样品(j)结合的磁性粒子(NS‑MPs_(j))并准备多个与目标分析物(i)结合的磁性粒子(PS‑MPs_(i))，其中所述磁性粒子是纳米尺寸或微米尺寸，并且其中i或j独立地是从1开始的整数；c)将经过加热和淬火以形成二级结构的所述随机序列库与所述NS‑MPs_(j)在第一结合缓冲液中一起培养，其中所述随机序列库与所述NS‑MPs_(j)逐个一起培养或与所有所述NS‑MPs_(j)一批一起培养；d)通过使用磁性架进行第一次磁性分离来去除与所述NS‑MPs_(j)结合的寡核苷酸，并收集含有未与所述NS‑MPs_(j)结合的剩余寡核苷酸的上清液供后续流程使用或作为一种随机序列库供下一轮步骤c)使用，其中如果在步骤c)中所述随机序列库与所述NS‑MPs_(j)逐个一起培养，那么所述方法步骤c)和d)进行j次，或如果所述随机序列库与所有所述NS‑MPs_(j)一批一起培养，那么所述方法步骤c)和d)进行一次；e)将含有所述剩余寡核苷酸的所述收集的上清液与所述PS‑MPs_(i)一起培养；f)通过使用所述磁性架进行第二次磁性分离来收集含有与所述PS‑MPs_(i)结合的寡核苷酸的结合混合物，去除含有未与所述PS‑MPs_(i)结合的寡核苷酸的上清液，并使含有与所述PS‑MPs_(i)结合的寡核苷酸的所述收集的结合混合物再分散于第二结合缓冲液中；g)使所述混合物溶液经受具有下限频率f_iL和/或下限强度H_iL的第一振荡磁场下的窗口‑MARAS，以将对所述PS‑MPs_(i)具有第一结合亲和力的寡核苷酸与所述PS‑MPs_(i)分离，并通过使用所述磁性架进行第三次磁性分离，接着去除含有与所述PS‑MPs_(i)分离的所述寡核苷酸的上清液，来收集含有与所述PS‑MPs_(i)结合的寡核苷酸的所述结合混合物；h)使含有与所述PS‑MPs_(i)结合的寡核苷酸的所述收集的结合混合物再分散于第三结合缓冲液中；i)使所述混合物溶液经受具有上限频率f_iU和/或上限强度H_iU的第二振荡磁场下的窗口‑MARAS，以将对所述PS‑MPs_(i)具有第二结合亲和力的寡核苷酸与所述PS‑MPs_(i)分离，并通过使用所述磁性架进行第四次磁性分离，接着收集含有对所述PS‑MPs_(i)具有第二结合亲和力的所述寡核苷酸的上清液来去除与所述PS‑MPs_(i)结合的对所述PS‑MPs_(i)具有第三结合亲和力的寡核苷酸，其中重复步骤e)至i)ⅰ次，或者重复步骤e)至i)i‑1次并接着进行步骤e)至h)一次，从所述PS‑MPs_(i)洗提对所述PS‑MPs_(i)的结合亲和力比对所述PS‑MPs_(i)的第一结合亲和力强的寡核苷酸，通过使用所述磁性架进行第五次磁性分离来收集含有对所述PS‑MPs_(i)的结合亲和力比对所述PS‑MPs_(i)的第一结合亲和力强的所述寡核苷酸的上清液，其中所述第二结合亲和力比所述第一结合亲和力强，并且所述第三结合亲和力比所述第二结合亲和力强，并且其中f_iL<f_iU≤f_(i+1)L和/或H_iL<H_iU≤H_(i+1)L；以及j)获得能够与PS‑MPs_(i)结合的所述寡核苷酸作为对所述目标分析物(i)具有差别亲和力的适配体。