[发明专利]一种能高效分解甲酰胺和氧化亚磷酸盐的重组大肠杆菌及其构建方法与应用

摘要

本发明公开了一种能高效分解甲酰胺和氧化亚磷酸盐的重组大肠杆菌及其构建方法与应用。本发明以大肠杆菌DH5α工程菌为宿主，将克隆得到的甲酰胺酶基因和亚磷酸脱氢酶基因依次连接在载体上得到重组质粒，并转化入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中，诱导培养得到重组大肠杆菌。本发明的重组大肠杆菌同时含有甲酰胺酶基因和亚磷酸脱氢酶基因，能同时表达甲酰胺酶分解甲酰胺生成NH4+和表达亚磷酸脱氢酶把亚磷酸盐氧化磷酸盐，为重组大肠杆菌工程菌提供生长繁殖所需要的氮源和磷源，而其他微生物不具备这两条获取营养途径，使重组大肠杆菌成为优势菌，解决了大肠杆菌在工业发酵中染菌问题，同时降低了发酵设备需求以及减少了抗生素的添加。

主权项

一种能高效分解甲酰胺和氧化亚磷酸盐的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)设计引物，PCR扩增甲酰胺酶基因上游引物A1(5'‑CGCGGATCCGATGAACGGACTGGGCGGCTTGAAC‑3')，下划线斜体为BamH I酶切点；下游引物A2(5'‑CCGGAATTCCGTCGCGCCGCGCCTCCCTTCGCTC‑3')，下划线斜体为EcoR I酶切点；以类芽孢杆菌Paenibacillus pasadenensis.CS0611的基因组为模板，克隆出1011bp的甲酰胺酶基因序列，命名为for；将克隆得到的基因序列for连接到载体pETDuet‑1上的第一个多克隆位点，再将重组载体转化到大肠杆菌DH5α，得到含有重组载体pETDuet‑for的重组大肠杆菌DH5α(pETDuet‑for)；(2)设计引物，PCR扩增亚磷酸脱氢酶基因上游引物B1(5'‑GAAGATCTGATGCTGCCGAAACTCGTTATAACTC‑3')，下划线斜体为BglⅡ酶切点；下游引物B2(5'‑GGGGTACCACATGCGGCAGGCTCGGCCTTGGGC‑3')，下划线斜体为Kpn Ⅰ酶切点；以肺炎克雷伯菌Klebsiella pneumonia.OU7的基因组为模板，克隆出1008bp的亚磷酸脱氢酶基因序列，命名为ptx；将克隆得到的基因序列ptx连接到pETDuet‑for的第二个多克隆位点上，得到甲酰胺酶基因for和亚磷酸脱氢酶基因ptx同时连接到同一表达质粒的重组质粒，命名为pETDuet‑for‑ptx；将重组质粒pETDuet‑for‑ptx转化入DH5α，得到重组大肠杆菌DH5α(pETDuet‑for‑ptx)；(3)转化表达重组菌株从重组大肠杆菌DH5α(pETDuet‑for‑ptx)中提取重组质粒pETDuet‑for‑ptx，并将重组质粒pETDuet‑for‑ptx转化入大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中，得到重组表达菌株BL21(DE3)(pETDuet‑for‑ptx)；(4)诱导培养重组大肠杆菌将得到的重组表达菌株BL21(DE3)(pETDuet‑for‑ptx)接种到LB培养基中，进行诱导培养后，收集菌体并加入到含有甲酰胺和亚磷酸盐的MOPS培养基中，继续培养得到重组大肠杆菌。