[发明专利]ManLAM的制备方法及其在制备治疗自身免疫疾病的药物中的应用

摘要

本发明公开了ManLAM的制备方法及其在制备治疗自身免疫疾病的药物中的应用。通过从结核分枝杆菌中获得粗糖提取物，PBS溶解获得粗糖溶解物，行SDS‑PAGE电泳后，将整块分离胶置于3%预冷的氯化钾溶液中并轻轻摇动，分离胶上出现乳白色条带；对34 kD附近的条带进行切取；将切取的条带置于无菌研钵反复研磨，加入2倍体积的去离子水浸泡研碎的胶条；10000 g离心15 min取上清，并冷冻干燥，得到ManLAM纯度不低于95%。该ManLAM刺激的免疫细胞IL‑10上升，具有免疫调节作用，能下调机体免疫细胞Th1型极化，对所有Th1型极化上升的自身免疫疾病均有治疗作用。

主权项

1.一种从结核分枝杆菌中提取纯化ManLAM的方法，其特征在于，包括如下步骤：1）、从结核分枝杆菌中获得粗糖提取物：(1) 接种结核分枝杆菌于7H9液体培养基大量培养，37 °C培养4周，其OD值为2.0，65 °C水浴中灭活2小时，离心力10000 g，离心15 min，收集结核分枝杆菌菌体，加入少量PBS重悬后再次离心收集菌体；(2) 将灭活后的结核分枝杆菌分散并冷冻干燥，使用10倍于菌体体积的混合溶剂重悬干燥后的菌体，于37 °C摇床中剧烈震荡脱脂12小时，所述混合溶剂是体积比为1：1的氯仿和甲醇的混合物；(3)离心力 10000 g，离心15 min离心，弃上清收集菌体沉淀，将菌体再次重悬10倍于菌体体积的混合溶剂中，于37 °C摇床中剧烈震荡脱脂12小时，所述混合溶剂是体积比为10：10：3的氯仿、甲醇和水的混合物；(4) 离心力10000 g，离心15 min离心，弃上清收集脱脂后的菌体，于‑80 °C冷冻后进行干燥；(5) 将脱脂干燥后的菌体再次重悬于5倍于菌体体积的PBS中，同时加入含有终浓度200 U/mL的DNase 、200 U/mL RNase、3 mM PMSF，充分混匀后精确测定体积，再加入Triton X‑114，其体积终浓度为PBS体积的8%，再次充分混匀，4 °C静置12小时；(6) 低温下离心力32000 g，离心30 min，小心吸取上层液相置于无菌管中并放置于37 °C温箱中至明显分层；(7) 取下层Triton X‑114液相，加入9倍Triton X‑114相体积的95%的冰乙醇后置于‑80 °C环境中12小时至沉淀析出；(8) 离心力10000 g，离心5 min低温离心，弃去上清收集沉淀，冷冻干燥；然后加入2倍体积的终浓度为2 mg/mL蛋白酶K溶液，于58 °C水浴2小时；(9) 透析除去氨基酸等小分子物质后，收集透析袋内液体再次干燥后备下一步分离纯化；2）ManLAM的分离：(1) 将透析冷冻干燥后的粗糖提取物称重后，加入灭菌PBS溶解并调整至浓度为10 mg/mL；(2) 配制浓缩胶4 %、分离胶浓度为12 %的聚丙烯酰胺凝胶；(3) 将粗糖溶解物加入上样缓冲液，行SDS‑PAGE电泳；(4) 电泳结束后，将浓缩胶切除，将整块分离胶置于浓度为3%预冷的氯化钾溶液中并轻轻摇动， 30秒分离胶上出现乳白色条带；(5) 按照对应的预染蛋白marker的分子量对34 kD附近的条带进行切取；(6) 将切取的条带置于无菌研钵反复研磨，加入2倍体积的去离子水浸泡研碎的胶条；(7) 离心力10000 g，离心15 min取上清，并冷冻干燥。