[发明专利]一种双层析法制备人纤维蛋白原的方法

摘要

本发明公开了一种双层析法制备人纤维蛋白原的方法，该方法包括以下步骤组分Ⅰ沉淀溶解、过滤；S/D病毒灭活；离子交换层析；一次超滤浓缩；肝素亲和层析；二次超滤浓缩；检测配制；分装冻干；轧盖及干热灭活。本发明采用离子交换层析结合肝素亲和层析，全程在常温环境生产，工艺流程短，产品纯度高，收率高，复溶时间短。

主权项

一种双层析法制备人纤维蛋白原的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)组分Ⅰ沉淀溶解、过滤：组分Ⅰ沉淀用10～15倍溶解液，20～26℃水浴搅拌至溶解完全，板框过滤，收集滤液；所述溶解液为：每1000ml注射用水含枸橼酸钠10～15g，氯化钠8～12g，盐酸赖氨酸3～6g,肝素钠3000～5000IU，用1MHCl调pH6.7～7.0，温度20～26℃；(2)S/D病毒灭活：按步骤(1)过滤液重量的1/10加入S/D溶液，使混合液中聚山梨酯80含量为1.0％，磷酸三丁酯含量为0.3％，缓慢升温至24.0～26.0℃，温度达到24.0℃并恒定后开始计时，恒温6小时；(3)离子交换层析：将步骤(2)所得溶液用Q Sepharose Fast Flow离子交换层析柱吸附，收集流穿液，吸附结束后，用3～5倍柱体积溶解液洗涤层析柱，洗涤液并入流穿液；(4)一次超滤浓缩：将步骤(3)所得流穿液超滤浓缩至组分Ⅰ重量的8～10倍，5～8倍透析液透析至蛋白浓度3.0％～3.5％(g/ml)，pH6.8～7.2；所述透析液为：1000ml注射用水中含枸橼酸钠8～12g，氯化钠3～6g，盐酸精氨酸30～36g，肝素钠500～1000IU，用0.5MNaOH调pH 6.8～7.2，温度20～26℃；(5)肝素亲和层析：凝胶使用UniGel‑DEAE凝胶，先用一次超滤液平衡层析柱，再将步骤(4)所得溶液上柱纯化，3～5倍柱体积一次超滤液洗涤，3～6倍柱体积洗脱液洗脱，收集洗脱液；所述洗脱液为：每1000ml注射用水中含枸橼酸钠10～20g，氯化钠55～100g，甘氨酸20～24g，用1M盐酸调整pH 6.8～7.2，液温20～26℃；(6)二次超滤浓缩：将步骤(5)所得洗脱液超滤浓缩，5～8倍透析液透析至蛋白浓度≥2.5％g/ml；所述透析液为：1000ml注射用水中含枸橼酸钠8～12g，氯化钠3～6g，甘氨酸20～24g，用0.5MNaOH调整pH 6.8～7.2，温度20～26℃；(7)检测配制：检测步骤(6)所得超滤液蛋白含量，用步骤(6)所述透析液稀释配制，使制品的蛋白含量为2.2～2.4％g/ml；(8)分装冻干：将步骤(7)配制后溶液分装至50ml冻干玻璃瓶中，每瓶装25ml，然后冷冻干燥；(9)轧盖及干热灭活：将步骤(8)冷冻干燥后制品轧盖，然后置99.5～100.5℃水浴中干热灭活30min。