[发明专利]一种基于双水相液滴的细胞3D培养水凝胶微球的制备方法

摘要

本发明提供了一种基于双水相液滴的细胞3D培养水凝胶微球的制备方法。该方法包括微流控芯片泵阀的集成、水凝胶材料的选择、水凝胶微球合成及细胞负载、细胞的3D培养等。本发明利用生物相容性极佳的微流控双水相液滴作为载体可控合成均一的水凝胶微球，并用于细胞体外3D培养，基于双水相体系良好的生物相容性及微流控技术的精准控制，该方法在体外微组织构建等方面具有极大的应用价值。

主权项

1.一种基于双水相液滴的细胞3D培养水凝胶微球的制备方法，其特征在于：包括下列步骤：(1)芯片泵阀的集成：利用常规软光刻的方法，制备PDMS芯片；在一个传统的“十字”流微流控液滴芯片中，集成气动阀控制系统；所述芯片主要由连续相入口(1)，气体入口(2)，分散相入口(3)，液滴出口(4)，分散相通道(5)，气体通道(6)，连续相通道(7)，主通道(8)和气动泵阀(9)组成；连续相入口(1)、分散相入口(3)分别通过连续相通道(7)、分散相通道(5)与主通道(8)连接，分散相通道与连续相通道汇聚到主通道处形成“十字”交叉口；气体入口(2)经气体通道(6)到达气动泵阀(9)，其中的气体驱动泵阀侧壁发生弹性形变；气动泵阀(9)的位置在“十字”交叉口上游的分散相通道(5)两侧，通过泵阀充气与静息两种状态周期性挤压分散相通道，从而使分散相间断性地进入连续相中，稳定可控地形成液滴；(2)水凝胶材料的选择：选用生物相容性和稳定性都很好的聚乙二醇(PEG)‑葡聚糖组成的双水相体系；所述PEG分子量范围：8000‑20000Da、浓度范围：10‑50％；葡聚糖分子量范围：70k‑500kDa、浓度范围：10‑30％；为了产生水凝胶微球，在分散相中可混入水凝胶预聚体；选用可以快速交联的水凝胶材料海藻素钠，使用的粘度范围：55‑1000cps、浓度范围：0.1‑2％；(3)水凝胶微球合成及细胞负载：细胞经消化后，细胞密度为10⁵‑10⁸个/ml的悬液与含有海藻酸钠的分散相溶液充分混匀后，通过分散相入口(3)作为整体通入到分散相通道(5)中，经过泵阀的分离与连续相的维持作用，在主通道(8)内稳定形成含有细胞的液滴；芯片出口(4)通入浓度为0.5‑4％CaCl₂溶液，快速原位交联海藻酸钠形成水凝胶微球；分散相流速0.01‑1μl/min，连续相流速0.5‑5μl/min，泵阀开关周期0.1‑1s，通过分散相流速、连续相流速、和泵阀开关周期的调节，可以控制液滴的大小、间距和其他参数；(4)细胞的3D培养:经过上述步骤制备的负载细胞的水凝胶微球可以经过离心收集，离心速率300‑800rpm，1‑3min，后直接转移到培养基中；即可在常规细胞培养条件下进行培养，培养期间每隔1‑3天换液一次，保证细胞营养，期间可以进行相关生物学表征。