[发明专利]用于rLj‑RGD3免疫原性检测的ELISA试剂盒

摘要

本发明公开一种用于rLj‑RGD3免疫原性检测的ELISA试剂盒，有吸附在固相载体上的抗原及标准曲线板，抗原依次按照如下步骤制备将rLj‑RGD3重组表达菌BL21培养至对数生长期；进行IPTG诱导；收集菌体并以每100 ml的菌体加4 ml 冰冷的1 X Binding buffer重悬细胞；置于冰上超声裂解细胞，直至溶液不再粘稠；14000 g 离心20 min取上清，弃沉淀；上清用0.45 µm的一次性除菌滤器过滤；His.Bind Column纯化，得rLj‑RGD3蛋白为抗原；用所得抗原免疫实验兔得rLj‑RGD3多克隆抗体为标准品，用桥接法ELISA绘制标准曲线，灵敏度达到纳克级。

主权项

一种用于rLj‑RGD3免疫原性检测的ELISA试剂盒，有吸附在固相载体上的抗原及抗体标准曲线，其特征在于：所述抗原依次按照如下步骤制备：（1）将rLj‑RGD3重组表达菌BL21培养至对数生长期；（2）进行终浓度为1 mM的IPTG诱导，诱导温度30 ℃；（3）10000 g 离心10 min收集菌体，弃上清，以每100 ml的菌体加4 ml 冰冷的1 X Binding buffer重悬细胞；（4）置于冰上超声裂解细胞，直至溶液不再粘稠；（5）14000 g 离心20 min取上清，弃沉淀；（6）上清用0.45 µm的一次性除菌滤器过滤；（7）His.Bind Column纯化：吸去His.Bind Column上室的贮液并打开下面管口；用10 ml的1x Binding Buffer对柱子进行平衡；上样；用10 ml的1x Binding Buffer洗柱；用10 ml的1x Wash Buffer洗柱；用5 ml的1x Elute Buffer洗脱目的蛋白；得rLj‑RGD3蛋白为抗原；所述标准曲线依次按照如下方法制备：（1）用所得rLj‑RGD3蛋白免疫两只实验兔：免疫前血清采集→每只兔采用50~200 μg rLj‑RGD3与完全佐剂混合进行首次免疫→第14日采用每兔50~200 μg rLj‑RGD3与不完全佐剂混合进行第二次免疫并于第21天采血进行效价测定→第35日采用每兔50~200 μg rLj‑RGD3与不完全佐剂混合进行第三次免疫并于第45天采血进行效价测定→第56日以每兔50~200 μg rLj‑RGD3与PBS混合进行第四次免疫→于第70日将动物进行安乐死收集血清；（2）血清用PBS等体积稀释，5000~10000 rpm离心15分钟，取上清→用10倍体积的PBS清洗亲和柱以平衡柱子→将稀释好的上清加入平衡好的柱子中，室温下混合摇动2~4小时或4 ℃过夜→用10倍体积的PBS清洗亲和柱→用2倍体积的抗体洗脱液洗涤柱子，以得到rLj‑RGD3多克隆抗体；（3）用辣根过氧化物酶对rLj‑RGD3蛋白进行标记；（4）在酶标板上以每孔50 μl的rLj‑RGD3抗原蛋白铺板，并于室温孵育1~2 h 或4 ℃过夜；（5）室温下用封闭液封闭至少30 min；（6）移除封闭液并洗板；（7）向包被rLj‑RGD3蛋白的相应微孔板中分别加入500ng/ml、750 ng/ml、1000 ng/ml、2000 ng/ml、3000 ng/ml、4000 ng/ml梯度浓度的rLj‑RGD3多克隆抗体100 μl/孔→25±2 ℃ 孵育60 分钟→加入1×洗液260 μl/孔，洗板4次→加入辣根过氧化物酶标记的rLj‑RGD3蛋白100 μl/孔，25±2 ℃ 孵育60分钟，形成rLj‑RGD3蛋白‑ 抗体‑rLj‑RGD3‑HRP 复合物→加入1×洗液260 μl/孔，洗板4次→加入TMB 显色液100 μl/孔→25±2 ℃ 孵育15 分钟→每孔加入终止液50 μl；（8）读取不同浓度rLj‑RGD3多克隆抗体对应的OD450值，绘制标准曲线。