[发明专利]采用敲除技术建立Gadd45a敲除兔模型的方法

摘要

一种采用敲除技术建立Gadd45a敲除兔模型的方法，属于生物技术领域。本发明的目的是利用Crispr/cas9技术敲除GADD45a基因，构建兔模型，探究该基因对于动物肝脏影响的采用敲除技术建立Gadd45a敲除兔模型的方法。本发明的步骤是构建sgRNA、合成双链DNA、p UC‑57载体线性化、连接p UC‑57载体和双链DNA、转化、单克隆的挑取及质粒DNA的提取、鉴定质粒测序、CAS9表达质粒，经酶切线性化，用于体外转录。本发明经过相关检测，成功获得Gadd45a敲除兔模型，该模型的获得能够在给予相应酒精刺激后模拟临床上脂肪肝、肝硬化和肝癌等肝功能病的病理过程，能更有效地预测新疫苗、新药和新诊断试剂等在临床应用中的效果，同时大大降低新药研发的风险，为临床研究提供基础模型。

主权项

一种采用敲除技术建立Gadd45a敲除兔模型的方法，其特征在于：①构建sgRNA：在Gadd45a基因第1个外显子处选取2个sgRNA序列作用靶点，合成两对寡聚核苷酸链：Sgrna1‑F TAGGTCGCGGTCCTCGGCGAAACCSgrna1‑RAAACGGTTTCGCCGAGGACCGCGA;Sgrna2‑F TAGGACTCTCCGCAATCCGGGTGCSgrna2‑R AAACGCACCCGGATTGCGGAGAGT；②合成双链DNA：两条合成的寡聚核苷酸链经退火形成双链DNA；反应条件：95℃ 5min后室温放置1h；双链DNA反应体系；③p UC‑57载体线性化：p UC‑57载体在与②中合成的DNA连接时，需要先经Bbs I线性化，并回收纯化；酶切反应体系表；④连接p UC‑57载体和双链DNA：按如下连接体系进行混样，简短离心，放入16℃连接仪连接过夜，连接反应体系表；⑤转化：（1）从‑80℃冰箱取50 μL感受态细菌，加入10 μL④中的连接产物，混匀，在冰上冷却30分钟；（2）42℃水浴热激90s，冰上冷却2分钟；（3）加200μL LB液体培养基，在恒温震荡培养箱37℃，250 rpm震荡培养30 min；（4）吸取200 μL菌液均匀地涂布在氨苄抗性LB平板上，放于37℃恒温培养箱中培养12小时；⑥单克隆的挑取及质粒DNA的提取：从培养基中挑取单菌落，接种于6 mL液体LB培养基中，培养基中含6 μL氨苄青霉素，放于摇床中，37℃培养12‑14h；将细菌中的质粒提取出来；⑦鉴定质粒测序使用M13通用引物对质粒进行测序分析，测序连接正确后可用于后续实验；⑧CAS9表达质粒，经酶切线性化，用于体外转录；CAS9mRNA的合成在体外利用T7RNA聚合酶完成，酶切37℃ 3h，电泳跑胶后，使用普通DNA琼脂糖胶回收试剂盒进行回收；酶切体系。