[发明专利]一种苹果腐烂病病原菌快速接菌及致病力快速鉴定的方法

摘要

本发明涉及一种苹果腐烂病病原菌快速接菌及致病力快速鉴定的方法，该方法是将苹果枝条和叶片用划布轮划伤，取苹果腐烂病菌黑腐皮壳菌Valsa mali 03‑8的菌饼，长菌面贴合在伤口处，将接种体保湿处理培养；叶片贴合菌饼后，保湿处理培养。经不同时间处理培养后，枝条和叶片会出现致病菌侵染后的病斑，可以根据观察记录发病数、测量病斑长度及叶片病斑面积，计算出枝条发病率、平均病斑长度和叶片病斑面积比率。本发明所述方法，叶片可在4天内发病，枝条可在5天内有病斑出现。该方法能够快速反应苹果树发病情况和菌株致病力，适用于田间试验，为苹果腐烂病机理和抗病基因挖掘研究提供研究方法依据。本发明所述方法简单、快速有效，获得稳定的植物—病原菌病症模型。

主权项

一种苹果腐烂病病原菌快速接菌及致病力快速鉴定的方法，其特征在于按下列步骤进行：苹果腐烂病病原菌的培养：a、采用PDA平板培养腐烂病病原菌，用直径5mm打孔器在黑腐皮壳菌Valsa mali 03‑8的菌落边缘打孔，所取下来的菌饼接种在PDA平板的中央，温度25℃暗培养3天待用，其中所用菌株黑腐皮壳菌Valsa mali 03‑8为腐烂病的强致病力菌株；枝条接菌处理：b、选取健康的新疆野苹果、栽培苹果或栽培海棠枝条，截成15cm长的小段，水冲洗干净后用浓度为70%酒精浸泡10min，然后用无菌水冲洗、晾干，枝条两端用石蜡封口待用；c、用浸泡浓度为70%酒精的脱脂棉球擦拭消毒划布轮，待酒精晾干用划布轮刺伤树皮，刺伤长度至2cm，备用；d、用打孔器在已培养好的PDA培养平板上打孔，取步骤a得到的菌饼贴在步骤c的刺伤部位，在接种上方0.5cm处覆一块脱脂棉，用移液枪在棉球上方悬空滴加800μl的无菌水使棉球浸湿，再用封口膜将其和接种体同时包扎；e、将滤纸浸湿铺平托盘，再将步骤d已接好菌的树枝平放置托盘，用保鲜膜覆盖好托盘，保持湿度，放置温度25℃培养8天后，记录枝条发病个数并用游标卡尺测量病斑长度；叶片接菌处理：f、选取生长完全展开的新疆野苹果、栽培苹果或栽培海棠叶片，大小均一，连叶柄处剪下，用自来水洗干净，用浓度为70%的酒精擦拭消毒叶片表面，再用已灭菌的二次水冲洗干净叶片表面酒精，在超净工作台中晾干待用；g、在培养方皿中平铺滤纸，加入已灭菌的二次水使滤纸完全浸湿，再弃去多余水，放入步骤f的叶片；h、用划布轮沿叶片主叶脉方向，远离主叶脉，划伤叶片2cm长的伤口，再将步骤a的菌饼贴放在刺伤伤口处，盖好培养皿，用封口膜封住培养皿以便保湿，温度25℃培养4天后，用叶面积扫描仪记录病斑面积与叶片面积；发病情况统计：i、侵染处理后第8天，按常规方法测量并统计枝条发病数以及各发病空病斑长度，根据记录的枝条病斑长度，计算出枝条发病率和平均病斑长度；j、侵染处理后第4天，按常规方法用叶面积扫描仪测量病斑面积和叶片面积，根据记录的叶片病斑面积和叶面积，计算出叶片病斑比率。