[发明专利]一种襄麦冬内生曲霉菌属真菌及在制备甾体皂苷中的应用

摘要

本发明的名称是一种襄麦冬内生曲霉菌属真菌及在制备甾体皂苷中的应用，涉及微生物技术领域。它主要是解决襄麦冬甾体皂苷目前大多直接来自于襄麦冬提取物，由于襄麦冬“甾体皂苷含量低”、“皂苷提取成本高”等因素导致襄麦冬甾体皂苷市场投放量受限的问题。本发明的曲霉菌分离自襄麦冬（

主权项

1.一种襄麦冬内生曲霉菌属真菌在制备甾体皂苷中的应用，其特征在于：所述的曲霉菌属真菌EF019分离自襄麦冬（Liriope spicata var . proliferaY .T .Ma）的活体块根，经18S rDNA序列鉴定为曲霉菌属（Aspergillus sp），所述的曲霉菌真菌已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为：2016年12月7日，保藏编号为：CCTCC No.M2016721；采用所述的曲霉菌菌株通过液体发酵制备得到襄麦冬甾体皂苷；/n液体发酵的培养基是马铃薯液体培养基（PDB），所述的液体发酵培养基的配方是：200g土豆，20g葡萄糖，1000ml蒸馏水；/n襄麦冬甾体皂苷的制备步骤如下：/n(1)取所述的曲霉菌属真菌菌株菌种，在无菌条件下，用接种针挑取少量菌丝，接入已灭菌的PDA培养基试管，于28℃活化培养72小时；/n(2)取活化培养后的菌种，在无菌条件下，转接入已灭菌的液体马铃薯种子培养基中，28℃下180rpm振荡培养72小时，得种子；/n(3)将配制好液体发酵培养基分别装入250ml的三角瓶中，每瓶约100ml，灭菌处理，冷却备用，无菌条件下，按照10%的接种量接入种子，28℃下180rpm振荡培养7天；/n(4)发酵完毕，将发酵固液混合物置于超低温冰箱中快速冷冻成固态后，使用小型冷冻干燥机进行低温冷冻干燥处理，得到干燥的发酵产物，研磨粉碎；/n(5)将发酵粉碎物转入锥形瓶中，加入100ml 75%乙醇60℃水浴 .5小时后，过滤，得滤液；同时，滤渣再加入100ml的75%乙醇，继续水浴1.5小时后再次过滤，合并2次滤液；/n(6)对滤液采用减压浓缩方法，去除乙醇，得到浸膏，加入100ml纯水溶解；/n(7)将上述浸膏水溶液转入分液漏斗中，加入40ml乙醚进行充分萃取，去除乙醚层，保留水层；/n(8)将水层溶解物转至新的分液漏斗中，加入100ml水饱和正丁醇进行充分萃取，去除水层，保留正丁醇层，减压浓缩去除正丁醇后，得浸膏，加入甲醇复溶得襄麦冬甾体皂苷；/n曲霉菌属真菌的分离步骤是：/n(1)将清洗干净的襄麦冬块根用75%(V/V)乙醇浸泡2min，用无菌水漂洗；再用有效氯含量4-6%的次氯酸钠溶液浸泡2min，最后用无菌水漂洗、蘸干；/n(2)将上述襄麦冬块根在无菌条件下剪去两头褐变部分，切割成0.5cm×0.5cm组织小片，含氨卞青霉素的PDA培养基上，所述氨卞青霉素的终浓度为50ug/ml，每皿植入2片，用parafilm封口膜将培养皿密封后置于28℃恒温培养；/n(3)5-7天后有菌丝长出，挑取菌丝尖端转移到新的PDA培养基上纯化培养，最终得到襄麦冬内生曲霉菌真菌EF019；/n曲霉菌属真菌18S rRNA基因序列如下：/nGGGCAGGGACGTAATCGGCACGAGCTGATGACTCGTGCCTACTAGGCATTCCTCGTTGAAGAGCAATAATTGCAATGCTCTATCCCCAGCACGACAGGGTTTAACAAGATTACCCGGACCTCTCGGCCAAGGTGATGTACTCGCTGGCCCTGTCAGTGTAGCGCGCGTGCGGCCCAGAACATCTAAGGGCATCACAGACCTGTTATTGCCGCGCACTTCCATCGGCTTGAGCCGATAGTCCCCCTAAGAAGCCAGCGGCCCGCAAACGCGGACCGGGCTATTTAAGGGCCGAGGTCTCGTTCGTTATCGCAATTAAGCAGACAAATCACTCCACCAACTAAGAACGGCCATGCACCACCATCCAAAAGATCAAGAAAGAGCTCTCAATCTGTCAATCCTTATTTTGTCTGGACCTGGTGAGTTTCCCCGTGTTGAGTCAAATTAAGCCGCAGGCTCCACGCCTTGTGGTGCCCTTCCGTCAATTTCTTTAAGTTTCAGCCTTGCGACCATACTCCCCCCAGAACCCAAAAACTTTGATTTCTCGTAAGGTGCCGAGCGGGTCATCATAGAAACACCGCCCGATCCCTAGTCGGCATAGTTTATGGTTAAGACTACGACGGTATCTGATCGTCTTCGATCCCCTAACTTTCGTTCCCTGATTAATGAAAACATCCTTGGCGAATGCTTTCGCAGTAGTTAGTCTTCAGCAAATCCAAGAATTTCACCTCTGACAGCTGAATACTGACGCCCCCGACTATCCCTATTAATCATTACGGCGGTCCTAGAAACCAACAAAATAGAACCGCACGTCCTATTCTATTATTCCATGCTAATGTATTCGAGCAAAGGCCTGCTTTGAACACTCTAATTTTTTCACAGTAAAAGTCCTGGTTCCCCCCACAGCCAGTGAAGGCCATGAGGTTCCCCAGAAGGAAAGGTCCAGCCGGACCAGTACTCGCGGTGAGGCGGACCGGCCAGCCAGACCCAAGGTTCAACTACGAGCTTTTTAACTGCAACAACTTTAATATACGCTATTGGAGCTGGAATTACCGCGGCTGCTGGCACCAGACTTGCCCTCCAATTGTTCCTCGTTAAGGGATTTAGATTGTACTCATTCCAATTACGAGACCCAAAAGAGCCCCGTATCAGTATTTATTGTCACTACCTCCCCGTGTCGGGATTGGGTAATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTTGGATGTGGTAGCCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAACCCTAATTCCCCGTTACCCGTTGCCACCATGGTAGGCCACTATCCTACCATCGAAAGTTGATAGGGCAGAAATTTGAATGAACCATCGCCGGCGCAAGGCCATGCGATTCGTTAAGTTATTATGAATCACCAAGGAGCCCCGAAGGGCATTGGTTTTTTATCTAATAAATACACCCCTTCCGAAGTCGAGGTTTTTAGCATGTATTAGCTCTAGAATTACCACAGGTATCCATGTAGTAAGGTACTATCAAATAAACGATAACTGATTTAATGAGCCATTCGCAGTTTCACAGTATAAAGTGCTATACTAGA。/n