[发明专利]一种卷烟烟气对水通道蛋白5亚细胞定位影响的检测方法

摘要

本发明涉及一种卷烟烟气对水通道蛋白5亚细胞定位影响的检测方法，属于生物应用技术领域。本发明方法利用BMP6处理细胞，模拟了干燥综合症发生时的细胞微环境,从而研究卷烟烟气对AQP‑5表达量的影响，相较于动物实验而言更为简单、高效；在卷烟烟气的捕集上采用了口腔仿生模拟装置，更贴合实际的人抽吸状态；同时采用了高内涵系统，可高通量检测多个样品对细胞AQP‑5亚细胞定位的影响，可快速准确可视的进行多样品检测；在图像分析步骤时对AQP5的亚细胞定位进行了半定量分析，提高了检测的精度。综上所述，该方法为卷烟烟气的功效性评价提供了一个新的快速手段。

主权项

一种卷烟烟气对水通道蛋白5亚细胞定位影响的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤（1），采用专利申请号为201520354840.8的一种用于研究主流烟气暴露于口腔中的仿生吸收装置，采用DMEM/F12细胞培养基浸润该装置的模拟人工口腔黏膜内壁；选取10‑20支重量和吸阻一致的烟支作为待检测样品，平衡后进行抽吸，抽吸结束后，取出仿生吸收装置的瓶体中的液体，得到仿生抽吸液体；步骤（2），将涎腺腺样囊性癌细胞经0.25%胰酶消化后，以2‑4×104个/mL细胞浓度接种于含有DMEM/F12细胞培养基的细胞培养板上，在37℃、5%CO2的条件下培养22‑26h后，加入骨形成蛋白6至终浓度为6ng/ml，处理2‑3d；步骤（3），移去步骤（2）中的培养上清，以步骤（1）得到的仿生抽吸液体稀释4‑8倍后的液体作为培养基继续在37℃、5%CO2的条件下对细胞进行培养22‑26h；步骤（4），培养结束后弃上清，加入4%多聚甲醛室温固定细胞9‑11min，再用含有0.2% Triton X‑100和1% BSA的PBS溶液使细胞膜通透；之后加入FITC标记的AQP5抗体至终浓度为100‑200μg/mL，室温避光孵育3‑4h，用PBS洗涤细胞培养板2‑3次；接着再加入Hoechst染色液至终浓度为5‑10μg/mL，室温避光孵育10‑20min后，用PBS洗涤细胞培养板2‑3次；步骤（5），用高内涵成像系统对细胞进行扫描，选择FITC和Hoechst荧光双通道对细胞进行扫描获取图片；步骤（6），使用高内涵分析软件中的Translocation‑Enhanced模块对图片进行分析，设置Hoechst作为对照，FTIC通道作为移位指标；测量Hoechst通道中细胞核的平均直径，并用Hoechst通道中细胞核的平均直径值作为细胞核的直径参数；同时测试FITC通道中不同细胞核的荧光强度，之后用测得的荧光强度的最大值和最小值所形成的范围作为细胞核的荧光强度范围；再测试FITC通道不同细胞核的荧光面积，并用测试所得到的面积的最大值和最小值所形成的范围作为细胞核的荧光面积范围；最后，根据细胞核的边缘设置细胞的内部区域和外部区域，根据以上设置计算外部区域和内部区域的FITC通道荧光强度的比值，该比值表征该待检测样品的烟气对水通道蛋白5亚细胞定位。