[发明专利]一种卷烟烟气对水通道蛋白5细胞mRNA表达量影响的检测方法

摘要

本发明涉及一种卷烟烟气对水通道蛋白5细胞mRNA表达量影响的检测方法，属于生物应用技术领域。本发明采用生物化学及细胞学方法，利用BMP6处理细胞，模拟了干燥综合症发生时的细胞微环境从而研究卷烟烟气对AQP‑5表达量的影响，相较于动物实验而言更为简单、高效；在卷烟烟气的捕集上采用了口腔仿生模拟装置，更贴合实际的人抽吸状态；同时采用了荧光定量PCR方法，可实时比较不同样品对AQP‑5 mRNA表达量的影响，从而为卷烟烟气的功效性评价提供了一个新的快速手段。

主权项

一种卷烟烟气对水通道蛋白5细胞mRNA表达量影响的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤（1），采用专利申请号为201520354840.8的一种用于研究主流烟气暴露于口腔中的仿生吸收装置，采用DMEM/F12细胞培养基浸润该装置的模拟人工口腔黏膜内壁；选取10‑20支重量和吸阻一致的烟支作为待检测样品，平衡后进行抽吸，抽吸结束后，取出仿生吸收装置的瓶体中的液体，得到仿生抽吸液体；步骤（2），将涎腺腺样囊性癌细胞经0.25%胰酶消化后，以2‑4×104个/mL细胞浓度接种于DMEM/F12细胞培养基上，在37℃、5%CO2的条件下培养22‑26h后，加入骨形成蛋白6至终浓度为6ng/ml，处理2‑3d；步骤（3），移去步骤（2）中的培养上清，以步骤（1）得到的仿生抽吸液体稀释4‑8倍后的液体作为培养基继续在37℃、5%CO2的条件下对细胞进行培养22‑26h；步骤（4），培养结束后弃上清，用0.25%胰酶消化细胞后，提取细胞总RNA；步骤（5），采用步骤（4）得到的RNA作为模板进行逆转录PCR合成cDNA；步骤（6），采用步骤（5）中的cDNA作为模板进行荧光定量PCR分析，采用SYBR Green法操作进行荧光定量PCR实验；PCR反应体系共20μL，其中，2×Mix 10μL、ddH2O 6.8μL、上游引物200nmol/L 0.4μL、下游引物200 nmol/L 0.4μL、ROX染料0.4μL，模板2μL；β‑actin为内参；PCR反应条件为，预变性95℃ 5min，变性96℃ 10s，退火／延伸60℃ 30s，共40个循环；AQP5引物：上游引物为5’‑actgggttttctgggtaggg‑3’，下游引物为5’‑gtggtcagctccatggtctt‑3’；内参引物：上游引物为5’‑ggagattactgccctggctccta ‑3’，下游引物为5’‑gactcatcgtactcctgcttgctg‑3’；步骤（7），数据分析：所得荧光定量PCR结果采用2‑ΔΔCt方法进行数据分析，得到该待检测样品烟气对水通道蛋白5细胞mRNA相对表达量。