[发明专利]一种利用纳米材料细胞传感器评价抗氧化多肽活性的方法

摘要

一种纳米材料细胞传感器、其制备方法以及利用该传感器评价抗氧化多肽活性的方法。涉及抗氧化能力测定领域，具体涉及一种基于细胞传感器对多肽的抗氧化活性评价新方法。以结肠腺癌细胞为感应原件，构建细胞凝胶三维网络结构，并结合纳米材料修饰电极，对多肽的抗氧化活性展开评定。本发明采用细胞模拟电化学信号的方法评价多肽的抗氧化活性，方法新颖，检测方便，对全面评价抗氧化物质的细胞保护作用具有较强的实用性。

主权项

1.一种利用纳米材料细胞传感器评价抗氧化多肽活性的方法，纳米材料细胞传感器，包括裸金电极，以及固定在裸金电极上的纳米铂粒子、纳米银线和结肠癌细胞Caco‑2，所述纳米材料细胞传感器的制备方法，包括如下步骤：a)、纳米铂粒子的电镀：将打磨后的裸金电极置于8～12mM的H₂PtCl₆溶液中，在电压‑0.3～‑0.1V，扫描速率100～200mV/s的条件下电镀250～350s；b)、纳米银线的修饰：将纳米银线溶解在去离子水中，然后滴加到镀铂的电极上，经10～15min日光灯照射，使纳米银线固定在电极表面得到纳米修饰电极；c)、凝胶的制备：将海藻酸钠添加至浓度为1×的DMEM培养液中，添加量为0.01～0.02g/mL，超声处理4～6min，使海藻酸钠均匀分布在DMEM培养液中；再将氧化石墨烯溶液至均布了海藻酸钠的DMEM培养液中，添加量为1.20～1.30mg/mL，均匀搅拌后采用超声波处理25～35min除气泡混匀；d)、Caco‑2细胞的培养：在37℃、CO₂含量为5％的环境中，于含有体积浓度为8～13％的胎牛血清的DMEM培养基中培养结肠癌细胞Caco‑2，培养5‑6天，隔天换液；e)、细胞固定：将含有Caco‑2细胞的DMEM悬浮液与凝胶按照1:1的体积比例混合，轻轻搅拌后吸取4～6μL滴加在纳米修饰电极的表面，接着将细胞电极浸没于CaCl2溶液中进行固定2～4min，制备得到纳米材料细胞传感器；其特征在于，包括如下步骤评价抗氧化多肽活性：1)、纳米铂粒子的电镀：将打磨后的裸金电极置于8～12mM的H₂PtCl₆溶液中，在电压‑0.3～‑0.1V，扫描速率100～200mV/s的条件下电镀250～350s；2)、纳米银线的修饰：将纳米银线溶解在去离子水中，然后滴加到镀铂的电极上，经10～15min日光灯照射，使纳米银线固定在电极表面得到纳米修饰电极；3)、凝胶的制备：将海藻酸钠添加至浓度为1×的DMEM培养液中，添加量为0.01～0.02g/mL，超声处理4～6min，使海藻酸钠均匀分布在DMEM培养液中；再将氧化石墨烯溶液至均布了海藻酸钠的DMEM培养液中，添加量为1.20～1.30mg/mL，均匀搅拌后采用超声波处理25～35min除气泡混匀；4)、Caco‑2细胞的培养：在37℃、CO₂含量为5％的环境中，于含有体积浓度为8～13％的胎牛血清的DMEM培养基中培养结肠癌细胞Caco‑2，培养5～6天，隔天换液；5)、细胞处理：5.1)、空白对照组：细胞按照1×10⁵接种至细胞板上，待细胞生长完全填充细胞板内底，用PBS清洗细胞2～3次，添加胰酶消化，收集细胞得到细胞悬浮液一；5.2)、氧化损伤组：细胞按照1×10⁵接种至细胞板上，待细胞生长完全填充细胞板内底，添加H₂O₂氧化损伤2～3h，然后用PBS清洗细胞2～3次，添加胰酶消化，收集细胞得到细胞悬浮液二；5.3)、多肽处理组：细胞按照1×10⁵接种至细胞板上，待细胞生长完全填充细胞板内底，添加溶解有多肽的DMEM溶液预处理10～12h后添加H₂O₂氧化损伤2～3h，然后用PBS清洗细胞2～3次，添加胰酶消化，收集细胞得到细胞悬浮液三；6)、细胞固定：将细胞悬浮液一、细胞悬浮液二、细胞悬浮液三分别与凝胶按照1:1的体积比例混合，混匀后分别吸取4～6μL滴加在修饰电极一、修饰电极二、修饰电极三的表面得到细胞电极一、细胞电极二和细胞电极三，然后将细胞电极一、细胞电极二和细胞电极三分别浸没于CaCl₂溶液中固定2～4min，最后置于5％CO₂的37℃培养箱孵育3～6min，取出得到细胞传感器一、细胞传感器二和细胞传感器三；7)、电化学检测：在含有1.0mM的Fe(CN)₆^3‑/4‑溶液中分别对细胞传感器一、细胞传感器二和细胞传感器三进行电化学方法检测，记录电流信号并分别读取峰值电流记为I，I_o，I_p；8)、判断多肽是否具有抗氧化性：8.1)、当I_o＞I时，说明细胞传感器有效，进而进入步骤8.2)评价多肽的抗氧化性；8.2)、当I≤Ip≤I_o时，说明该多肽有抗氧化性，当I_o≤Ip时，说明该多肽没有抗氧化性。