[发明专利]一种高通量全人源抗体的制备方法及应用

摘要

本发明涉及基因工程及抗体制备，具体公开了一种高通量全人源单克隆抗体的制备方法及应用。所述制备方法包括分离外周血单核细胞，分选浆细胞或抗原特异性记忆B淋巴细胞的单细胞，利用本发明人所提供的引物对单个B细胞抗体的重链和轻链基因可变区进行扩增，利用含重链片段或轻链片段恒定区的线性表达系统载体构建含抗体重链、轻链基因的表达系统，最终实现全人源单克隆抗体的分离纯化。其中，采用本发明所提供的引物组合扩增抗体重链和轻链可变区基因，可保留轻链、重链可变区的天然配对，具有基因多样性好、效价高、全人源、抗体亲和力好、特异性强、无异种血清反应、没有传播其他传染性疾病的危险等优势。

主权项

1.一种高通量全人源抗体的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)分离外周血单个核细胞：传染性疾病自愈患者的血液样本或者自身免疫性疾病或者肿瘤患者产生自身抗体的血液样本，分离PBMC；(2)分选单个B细胞：所述单个B细胞为抗原特异性浆细胞和/或抗原特异性记忆B淋巴细胞；分选抗原特异性浆细胞采用的荧光标记选自以下三个组合中的一种：组合一：AqVD‑Amycan‑/CD19‑BV605+/CD3/14/16/235a‑PE‑Cy5‑/CD20‑PerCP‑/IgD‑PE‑/CD138‑FITC‑/CD38‑AF647+/CD27‑BV421+；组合二：AqVD‑Amycan‑/CD19‑PE+/CD3/14/16/235a‑PE‑Cy5‑/CD20‑PerCP‑/IgD‑BB515‑/CD138‑PE‑CF594‑/CD38‑AF647+/CD27‑BV421+；组合三：AqVD‑Amycan‑/CD19‑PerCP+/CD3/14/16/235a‑PE‑Cy5‑/CD20‑PE‑Cy7‑/IgD‑PE‑/CD138‑FITC‑/CD38‑BV605+/CD27‑BV421+；分选抗原特异性记忆B淋巴细胞采用的荧光标记选自以下三个组合中的一种：组合一：AqVD‑AmCyan‑/CD16‑PE‑Cy7‑/CD14‑BV570‑/CD3‑PerCP5.5‑/CD20‑FITC‑/IgD‑PE‑/CD27+/特异性抗原‑AF647+/特异性抗原‑BV421+；组合二：AqVD‑AmCyan‑/CD3/CD16/CD235a‑PE‑Cy5‑/CD14‑FITC‑/IgD‑PE‑/IgM‑APC‑/CD20‑BV605+/CD27‑APC‑H7+/特异性抗原‑PE‑Cy7+/特异性抗原‑BV421+；组合三：AqVD‑AmCyan‑/CD3/CD16/CD235a‑PE‑Cy5‑/CD14‑PerCP‑/IgD‑PE‑/IgM‑FITC‑/CD20‑PE‑CF594+/CD27‑APC‑H7+/特异性抗原‑AF647+/特异性抗原‑BV421+；(3)单个B细胞基因扩增与分析：对单个B细胞进行反转录合成cDNA，扩增抗体重链和轻链可变区基因；(4)构建含抗体重链、轻链基因的线性表达系统：通过overlapping PCR的方法将步骤(3)分离得到的抗体重链、轻链可变区基因分别连入线性载体表达系统中；(5)抗体的分离纯化：将步骤(4)得到的线性载体表达系统导入宿主细胞进行表达，收集表达的上清，纯化抗体；其中，步骤(3)通过巢式PCR扩增抗体重链和轻链可变区基因：第一轮巢式PCR扩增重链、轻链λ和轻链κ全长基因，所用引物如表2、表3、表4所示；第二轮巢式PCR分别扩增重链、轻链λ和轻链κ可变区基因，所用引物表5、表6、表7所示；重链可变区扩增产物一端序列与部分Ig引导区序列重合，另一端序列与部分重链的恒定区序列重合；轻链λ可变区扩增产物一端序列与部分Ig引导区序列重合，另一端序列与部分轻链λ的恒定区序列重合；轻链κ可变区扩增产物一端序列与部分Ig引导区序列重合，另一端序列与部分轻链κ的恒定区序列重合。