[发明专利]基于1H-NMR的代谢组学鉴别鲜鹿茸与热炸茸的方法

摘要

基于¹H‑NMR的代谢组学鉴别鲜鹿茸与热炸茸的方法，属于中药鉴定技术领域。本发明应用¹H‑NMR的代谢组学技术研究鲜鹿茸与热炸茸的化学成分差异，通过多元数据处理模式对鹿茸鲜品和炮品进行鉴别。与现有鹿茸鉴定技术相比，本发明具有明显的优势：从整体上阐明鹿茸的代谢产物，能系统的比较代谢产物之间的差异；PCA、PLS‑DA与OPLS‑DA层层递进，保证了实验结果的准确性；丰富的核磁数据结合现代高科技分析软件，能保证实验结果的稳定、可控，具有宏观准确性和微观精确性。该方法还具有简单、方便、快速、经济，适合于市场和一般个体应用的广泛性和简便性。

主权项

1.基于¹H‑NMR的代谢组学鉴别鲜鹿茸与热炸茸的方法，其特征是：包括以下步骤，并且以下步骤顺次进行，步骤一、对鹿茸样品进行分离处理取新鲜二杠茸2～4只，用酒精灯火燎去毛后，纵向切成2份,1份作为鲜品备用，1份用保鲜膜裹住断面，通过传统热炮制方法获得热炸茸炮制品；步骤二、对鹿茸鲜品与炮制后的热炸茸样品进行提取处理①鹿茸鲜品的提取处理称取鹿茸鲜品20g，加入8～12倍重量份的水，通过组织粉碎机破碎10min至颗粒状，在4℃下浸提18h～30h，取出,离心10min,离心转速为3600r/min，取上清液用微滤膜进行微滤,将微滤液冻干,获得鹿茸鲜品冻干粉末备用；②热炸茸样品的提取处理称取热炸茸炮制品20g，加入8～12倍重量份的水，通过组织粉碎机破碎10min至颗粒状，在4℃下浸提18h～30h，取出,离心10min,离心转速为3600r/min，取上清液用微滤膜进行微滤,将微滤液冻干,获得热炸茸炮制品冻干粉末备用；步骤三、对鹿茸鲜品与热炸茸炮制品进行核磁测定前处理①鹿茸鲜品的核磁测定前处理称取鹿茸鲜品40mg，置于10mL离心管中,向离心管中加入体积浓度80％的乙腈4ml～6ml，超声溶解1min,室温下离心20min～40min，离心转速为2000r/min～6000r/min，取上清液，75℃水浴挥干，获得鲜鹿茸样品；将鲜鹿茸样品溶解于450ul～550ul含质量浓度为0.05％的磷酸三钠TSP的缓冲盐溶液中，加入50ul～150ul重水D₂O混和，将溶解后的混合液转入5mm核磁管中进行核磁¹H‑NMR测定；②热炸茸样品的核磁测定前处理称取热炸茸炮制品冻干粉末40mg，置于10mL离心管中,向离心管中加入体积浓度80％的乙腈4ml～6ml，超声溶解1min,室温下离心20min～40min，离心转速为2000r/min～6000r/min，取上清液，75℃水浴挥干，获得热炸茸样品，将热炸茸样品溶解于450ul～550ul含质量浓度为0.05％的磷酸三钠TSP的缓冲盐溶液中，加入50ul～150ul重水D₂O混和，将溶解后的混合液转入5mm核磁管中进行核磁¹H‑NMR测定；步骤四、进行核磁¹H‑NMR测定将步骤三中溶解后的鲜鹿茸样品和热炸茸样品分别通过核磁共振图谱仪进行测定，所述核磁共振图谱仪为400MHz NMR仪，设定温度为26.8℃，核磁测定采用序列压制水峰，用重水D₂O锁场，内标为TSP，扫描次数为64，谱宽为8196.7HZ，脉冲时间为14μs，采样时间3.997s，延迟时间10s，采样数据点为65536，分别获得鲜鹿茸样品图谱和热炸茸样品图谱；步骤五、对1H‑NMR测定的鹿茸样品图谱进行数据整理获得鲜鹿茸与热炸茸差异性代谢产物通过MestReNova软件对所述步骤四中获得的鲜鹿茸样品图谱和热炸茸样品图谱数据化，再将数据导入SIMCA‑P 11.0软件进行多元统计，分别获得鲜鹿茸样品和热炸茸样品的差异性代谢产物及其相对含量，并形成得分投影图和载荷图作为待测样品的对比数据库：其中差异性代谢产物及其相对含量为：热炸茸中甘氨酸、磷酸胆碱、缬氨酸、亮氨酸、牛磺酸、丙氨酸、尿苷、苯丙氨酸、尿嘧啶和酪氨酸的含量均高于鲜鹿茸，脂肪酸、胆碱、苏氨酸、脂类物质2和琥珀酸均低于鲜鹿茸；步骤六、对待测样品进行品质判定称取待测样品，按照步骤二至步骤五中对于鹿茸鲜品或热炸茸样品的处理方法获得待测样品的得分投影图和载荷图，将待测样品的得分投影图和载荷图与对比数据库的得分投影图和载荷图进行对比，待测样品的代谢产物及含量70％～90％以上与鲜鹿茸样品的代谢产物及含量一致判定为鲜鹿茸，待测样品的代谢产物及含量70％～90％以上与热炸茸样品的代谢产物及含量一致判定为热炸茸，待测样品的代谢产物及含量40％～60％以上与鲜鹿茸样品以及热炸茸样品的代谢产物及含量均不一致判定为假鹿茸。