[发明专利]一种分离鉴别大丽轮枝菌的方法

摘要

本发明涉及一种分离鉴别大丽轮枝菌的方法，其特征在于将采集到的病样用纸袋保存，新鲜病样用火焰灼烧法，干燥病样用次氯酸钠消毒法分离病原菌，纯化获取单孢菌株后，‑70℃保存。刮取在铺有玻璃纸的PDA平板上的菌丝体，提取基因组DNA，用引物D‑1/D‑2和ND‑1/ND‑2 PCR检测菌株的致病类型。对检测不到条带的菌株，用通用引物ITS1/ITS4 PCR扩增其rDNA‑ITS区段，纯化测序后BLAST比对分析，从而鉴别是否为大丽轮枝菌。本发明避免对所有菌株都进行测序比对，大大缩短了病原菌鉴定的时间，对黄萎病抗病育种和综合防治具有重要价值。

主权项

一种分离鉴别大丽轮枝菌的方法，其特征在于：a、病样的采集：在黄萎病地中，选择症状典型的重病株；剪取植株的一段主干，去除侧枝；装于纸质信封中或者用纸包好；在信封或报纸上写明采集地点，采集品种，采集人和采集时间；对病样进行编号，室温晾干，4℃保存；b、病原菌的分离：新鲜的病样采用火焰灼烧法，在超净台中，将剪刀、镊子分别蘸酒精后，再将酒精烧去，重复两次，进行消毒；然后将病杆在70％的酒精中浸过后，将酒精烧去，如病杆表皮容易剥离，则将表皮组织拨开，用剪刀剪去；然后将维管束剪成小块(1cm×2cm)，用镊子选取小块变色的维管束组织，移至含有氯霉素的PDA平板上，每个平板4‑5个小块，28℃培养5‑7d；如果病杆特别干燥，不适合用火焰灼烧法，则采用次氯酸钠消毒法，在超净台中，将剪刀、镊子分别蘸酒精后，再将酒精烧去，重复两次，进行消毒；将病杆用自来水冲洗干净晾干，如病杆表皮容易剥离，则将表皮组织拨开，用剪刀剪去，再将病杆剪成约1cm×2cm大小的小块；然后置于70％的乙醇中2‑5min后，用无菌水洗涤1次；再将病杆小块移至4％次氯酸钠中8‑10min，然后用无菌水中洗涤4‑5次；用镊子选取小块变色的维管束组织，移在含有氯霉素的PDA平板上，每个平板4‑5个小块，28℃培养5‑7d；c、病原菌的纯化与保存：在超净台中，根据平板中病杆小块周围长出菌落的形态，选取菌落边缘少量菌丝块接种于PDA平板上，28℃培养3‑5d。同时，挑取少量菌丝加入含有1mL无菌水的1.5mL的离心管中，涡旋振荡1min，取10‑20μL涂布在PDA平板中，25℃培养至长出单克隆，挑出单克隆至装有液体PDA培养基的三角瓶中，25℃，150r/min摇床培养3‑7d。取摇好的菌液0.5mL与50％甘油1∶1混合，‑70℃超低温冰箱保存；d、菌株基因组DNA提取：将活化后菌株的孢子液均匀涂布在铺有玻璃纸的PDA平板上，25℃培养5d，从玻璃纸上刮取菌丝体，在吸水纸上压干，放入2mL离心管中，加入适量石英砂混匀。液氮冷冻后，用电钻(博世GBM10RE)将菌丝体研磨成细粉状。采用CTAB法提取菌株基因组DNA；e、PCR检测菌株的致病类型：采用Pérez‑Artés E等设计的特异性引物，D‑1(CAT GTT GCT CTG TTG ACT GG)、D‑2(GAC ACG GTA TCT TTG CTG AA)，检测菌株是否为落叶型菌系，扩增产物大小为550bp；ND‑1(CAG GGG ATA CTG GTA CGA GAC G)、ND‑2(ATG AGT ATT GCC GAT AAG AAC A)，检测菌株是否为非落叶型菌系，扩增产物大小为1500bp；PCR扩增的反应液总量为25μL，以稀释10倍的基因组DNA为模板，退火温度为58℃；PCR扩增产物在0.8％琼脂糖凝胶上电泳，于紫外凝胶成像仪上观察结果；f、ITS序列PCR鉴定：对于特异性引物D‑1/D‑2和ND‑1/ND‑2都PCR检测不到条带的菌株，采用真核生物核糖体DNA通用引物ITS1(TCC GTA GGT GAA CCT GCG G)、ITS4(TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC)PCR扩增菌株的rDNA‑ITS区段，扩增产物大小为540bp左右；PCR扩增的反应液总量为25μL，以稀释10倍的基因组DNA为模板，退火温度为50℃；PCR扩增产物在0.8％琼脂糖凝胶上电泳，于紫外凝胶成像仪上观察结果；对PCR产物进行纯化和测序，将测序结果在GenBank中进行BLAST比对分析，从而鉴别是否为大丽轮枝菌。