[发明专利]用于微量DNA超低频突变检测的双分子自校验文库制备及杂交捕获的二代测序方法

摘要

本发明公开了用于微量DNA超低频突变检测的双分子自校验文库制备及杂交捕获的二代测序方法。该方法包括如下步骤：血浆游离DNA提取，DNA化学错误修复，自校验双分子识别码发夹型接头制备，血浆游离DNA修复，DNA与接头连接，Pre‑PCR扩增，超量杂交捕获，Post‑PCR扩增，上机测序，数据纠错校正，突变分析与注释。本发明的方法可以高效实现血浆循环游离DNA的低频突变检测。DNA错误修复和双重冗余校验技术使得该方法在检测微量样本时具有超低的假阳性率和高灵敏度，避免了现有血浆循环游离DNA检测方法的缺陷，不仅可以实现癌症突变检测和靶向用药指导，也可实现胎儿遗传和出生缺陷早期筛查。

主权项

一种循环游离DNA超低频变异检测的方法，包括如下步骤：(b1)将待测循环游离DNA连接接头，得到DNA文库；所述接头是一茎环结构的DNA分子；构成所述接头的DNA序列自5'末端至3'末端依次包括固定间隔序列甲、随机分子标签序列甲、颈环序列、随机分子标签序列乙和固定间隔序列乙；所述固定间隔序列甲为由X个任意碱基组成的序列，所述碱基为A、G、C或T；所述X为自然数，1≦X≦4；所述固定间隔序列乙的3’末端为胸腺嘧啶核苷酸，剩余部分与所述固定间隔序列甲反向互补；所述随机分子标签序列乙与所述随机分子标签序列甲反向互补；所述随机分子标签序列甲自5'末端至3'末端依次由M个3联体单元组成；所述M为大于等于2的整数；每个3联体单元均为NNN，所述N为A、G、C或T；将M个3联体单元中的第一个3联体单元记作3碱基指示序列，所述3碱基指示序列是从四种碱基中任选三种再进行排序得到的，所述3碱基指示序列的种类可为一种、两种或多种；且，在同一种3碱基指示序列下，每一条随机分子标签序列甲中，除了3碱基指示序列外的所有(M‑1)个3联体单元中任意两个3联体单元相比，至少有两个碱基不同；所述颈环序列自5’末端至3’末端依次由茎段甲、茎段乙、茎段丙和茎段丁组成；所述茎段甲与所述茎段丁反向互补；所述茎段乙和所述茎段丙之间形成可被蛋白酶切断的结构；(b2)将所述DNA文库进行杂交捕获，得到杂交后文库；(b3)将所述杂交后文库进行测序，得到测序结果，根据所述测序结果进行突变分析。