[发明专利]一种应用斑马鱼评价量微样品抗骨质疏松活性与安全性新方法

摘要

本发明涉及用模式生物斑马鱼骨质疏松模型、斑马鱼代谢方法及斑马鱼毒性评价有机联合的应用新方法，具体涉及斑马鱼代谢‑抗骨质疏松活性/毒性一体化评价新方法。实验样品用量少，至多需几mg，实验采用受精后1‑3天斑马鱼胚胎或幼鱼在微孔板中进行，实验周期约1周。采用糖皮质激素诱导的斑马鱼骨质疏松模型快速评价量微成分的抗骨质疏松活性；另同步或联合斑马鱼毒性评价，观察测试药对斑马鱼的死亡情况或脏器形态的变化；进一步考查抗骨质疏松活性或毒性评价过程中，测试药经斑马鱼作用后的代谢转化，采用高效液相色谱或联用质谱技术分析代谢产物。本发明为抗骨质疏松药物筛选提供新技术方法，对发现安全有效抗骨质疏松药物具有意义。

主权项

一种斑马鱼骨质疏松模型、斑马鱼代谢方法及斑马鱼毒性评价一体化应用方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：斑马鱼受精卵的收集：控制斑马鱼成鱼日夜节律，昼夜时间控制在14‑12小时：10‑12小时，收集受精卵，置于培养皿中，加入培养基，于26℃‑30℃恒温培养箱中培养；步骤二：给药方案：取受精后1‑3天斑马鱼胚胎或幼鱼放入盛有胚胎培养基的培养板中，根据培养板孔的大小每孔加入培养基1‑2mL，每个孔里放6‑10条幼鱼，分为数组，溶媒阴性对照组和测试药物组，加药方法是吸净培养板孔里的培养基后迅速加入溶液，溶媒对照浓度与药物测试组的溶媒浓度相当，将培养板密封放入26℃‑30℃恒温培养箱中培养，培养周期5‑7天，必要时隔天将每个孔里的溶液用移液枪吸出一半，加入等体积新溶液，培养至斑马鱼胚胎受精后6‑10天；步骤三：将培养至受精后8‑10天斑马鱼置于100mg/L的MS‑222中麻醉致死，去除MS‑222溶液，然后将幼鱼固定于4％多聚甲醛磷酸盐缓冲液中2‑3h，将固定液4％多聚甲醛磷酸盐缓冲液去除，然后将斑马鱼幼鱼置于PBST溶液中洗涤3次，每次10min，然后置于含3％H2O2和1％KOH的混合溶液中漂白30min～2h，至斑马鱼眼部色素清除后去除漂白液，再用PBST洗涤幼鱼3次，每次10min，将幼鱼置于茜素红染色液中数小时至过夜，去除染色液后，依次通过3:1、1:1、1:3的1％KOH和甘油的混合溶液透明幼鱼，最后保存于纯甘油中；步骤四：斑马鱼骨骼染色的检测与分析：用倒置显微镜观察步骤三中茜素红染色的斑马鱼头骨腹面，用成像软件采集图像，所有的图像均采用相同的光强度和曝光设置；用专业图像分析软件计算茜素红染色区域的面积和累积光密度，以分别反应骨矿化量和骨密度，计算平均值，标准偏差，并进行t‑检验；步骤五：代谢产物的检测与分析：斑马鱼给药期间为受精后1天到受精后10天，可定时取药液，采用高效液相色谱或联用质谱技术分析代谢产物；步骤六：斑马鱼安全性评价：斑马鱼给药期间为受精后1天到受精后10天，每天用计算半数致死浓度LC50计数鱼死亡数量，显微镜观察主要脏器毒性。