[发明专利]一种莪术茎尖玻璃化超低温保存及解冻方法

摘要

本发明公开了一种莪术茎尖玻璃化超低温保存及解冻方法，主要包括丛生芽诱导培养、继代培养、预培养、装载液处理、玻璃化保护液处理、迅速冷冻以及解冻处理等步骤。本发明建立起莪术种质资源的超低温保存的技术程序，填补了莪术茎尖超低温保存技术的空白；本发明所采用的冰冻保护剂成本低、毒性低，冷冻介质液氮性质稳定、容易制得和价格便宜，且超低温保存操作简单，减少了在各项操作过程中对茎尖的机械损伤，经保存后的茎尖生活力仍然可高达79％，一次保存可以长期稳定存放，简化传统种植和组培育苗需要频繁继代的繁琐操作。本发明提供的解冻方法操作简单，使细胞在解冻过程中未受到机械损伤，莪术茎尖的生活力未受影响。

主权项

一种莪术茎尖玻璃化超低温保存方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：切取莪术块茎上萌发的嫩芽，洗净后进行预处理，然后接种到丛生芽诱导培养基上，在培养箱中培养至长出丛生芽；S2：切取莪术组培苗带芽茎段，在丛生芽诱导培养基上进行15～60天的继代培养；S3：切取莪术茎尖，在黑暗条件下用含0.3～0.7mol/L蔗糖的MS固体培养基分别预培养1～7天后，进行后续装载处理；S4：将步骤S3预培养后的莪术茎尖用装载液LS溶液或60％PVS2溶液在25±2℃条件下处理5～30min；S5：再将莪术茎尖用100％PVS2溶液作为玻璃化保护液在冰浴条件下处理15～90min；S6：将步骤S5处理后的莪术茎尖迅速投入液氮中冷冻16～18h。