[发明专利]NBS320型生物反应器固定床灌流培养制备RABV‑dG株狂犬病病毒液的方法

摘要

本发明公开一种应用NBS320型生物反应器固定床灌流培养技术制备高滴度RABV‑dG株狂犬病病毒液的工艺方法，具体涉及使用NBS320型生物反应器培养Vero细胞过程中溶氧、pH值、温度、转速、气流量的参数组合；病毒接种量，从而获得高滴度的RABV‑dG株狂犬病病毒液。

主权项

一种应用NBS320型生物反应器固定床灌流培养技术培养Vero细胞制备高滴度RABV‑dG株狂犬病病毒液的方法，通过对溶氧、pH值、温度、转速、气流量参数的调整组合获得高密度状态良好的Vero细胞，以一定的比例接种RABV‑dG株狂犬病病毒，然后通过对溶氧、pH值、温度、转速、气流量参数的组合调整获得高滴度RABV‑dG株狂犬病病毒液，其特征在于，包括以下步骤：a)用添加有4mM L‑谷氨酰胺、体积比5％～10％新生牛血清、pH值被调节为7.2‑7.4的VP‑SFM培养基培养Vero细胞；b)使用NBS320型生物反应器，在罐体固定床提篮内添加片状载体，连接常规进液、补液、补碱、废液等管道，连同细胞接种瓶、补液瓶、碱液瓶及废液瓶，对上述进行常规高压蒸汽灭菌后将各管道对应无菌连接，接上O2、N2、Air、CO2气体软管；c)将步骤a)中培养的Vero细胞经消化后接种至步骤b)中的生物反应器中，接种量为5.0×108个/L‑9.0×108个/L培养液，设置并控制溶氧、pH值、温度、转速、气流量参数，进行细胞培养；d)细胞接种10‑20h后，开始使用添加有4mM L‑谷氨酰胺、体积比5％～10％新生牛血清、pH值被调节为7.2‑7.4的VP‑SFM培养基灌流培养，灌流量每天提高，依次为半个工作体积、一个工作体积、一个工作体积、两个工作体积，反应器内培养体积恒定；灌流量是指进液量＝出液量；e)细胞接种后3‑4天，按0.05±0.02MOI加入RABV‑dG株狂犬病病毒，调整溶氧、pH值、温度、转速、气流量参数，吸附6‑12小时后开始灌流培养，灌流液为添加有4mM L‑谷氨酰胺、pH值被调节为7.2‑7.4的VP‑SFM培养基，灌流量为每天一个工作体积；f)病毒接种64±8小时后开始收获病毒液，每天收获一个工作体积，连续收获14‑20天；g)对每天收获的病毒液进行滴度检测。