[发明专利]一种整合microRNA和CAR功能的载体构建方法

摘要

本发明涉及一种整合microRNA和CAR功能的载体构建方法，能在表达microRNA(以hsa‑miR‑301a为例)模拟物或阻遏物的同时表达CD19‑CAR的基于pFIV载体的pFIV‑microRNA(miR‑301a)‑CD19CAR系统；通过引入microRNA模拟物或阻遏物到携带有CAR序列的载体中，实现同时表达microRNA基因调控功能和肿瘤特异性抗原CD19的CAR，从而实现双重对T细胞的基因编辑和修饰功能，从而制备出新一代的具有更高安全性和有效性的CAR，更加适用于临床研究。

主权项

一种整合microRNA和CAR功能的载体构建方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)构建含有microRNA(以hsa‑miR‑301a为例)模拟物(pre‑miR‑301a)和阻遏物(sponge‑miR‑301a)的载体，并由H1启动子驱动。构建含有CAR(以CD19‑CAR为例)由EF1α驱动并包括：CD19的单链抗体可变区(single chain variable fragment,scFv)基因片段序列，CD8来源的连接和穿膜片段序列，传递信号的效应分子CD3ζ序列和胞内信号分子CD28和4‑1BB片段序列组成；(2)采用合成、酶切、连接和转化的方法，分别将hsa‑miR‑301a(模拟物或阻遏物)和CD19‑CAR结构序列连接到含有H1和EF1α的第三代FIV载体上(名称为：pFIV‑miR‑301a‑CD19CAR)，将连接产物转入大肠杆菌感受态DH5α中进行大量扩增并提取质粒；(3)共转染质粒pFIV‑miR‑301a‑CD19CAR和FIV慢病毒包装质粒(pFIV‑34N和pVSV‑G质粒)于293T细胞，收集293T细胞上清，并制备慢病毒颗粒，感染Jurkat细胞。采用荧光定量PCR检测miR‑301a表达，流式细胞技术检测myc‑tag标签来显示CD19‑CAR在细胞膜的表达水平。